Preparation and Testing of Multiplex R3T One-Step RT-qPCR Kit Components

首先，在不含 DNase/RNase 的水中制备用于 RT-qPCR 的 2X 缓冲液。将缓冲液储存在零下 20 摄氏度直至进一步使用。接下来，将引物和探针混合在 1.5 毫升管中。

用洗脱缓冲液补足体积。然后将试管存放在零下 20 摄氏度。在冰上的1.5毫升管中制备含有Taq聚合酶和M-MLV RT的酶混合物。

用Taq聚合酶储存缓冲液补足体积。现在将病毒合成RNA重新悬浮在含有100微升Tris-EDTA缓冲液的单独试管中，以使每微升10至6个RNA拷贝的储备液。要混合病毒储备，将 SARS-CoV-2 甲型和乙型流感各 5 微升加入 50 微升 Tris-EDTA 缓冲液中。

同样，将 SARS-CoV-2 和 MERS-CoV 混合以获得第二种病毒混合物。将两种混合物稀释十倍，以获得每微升 10 个 RNA 拷贝的最终稀释度。向 96 孔板的每个孔中，移液 2X 缓冲液、引物、酶、不含 DNase/RNase 的水和相应的 RNA 混合物。

用粘性板密封板密封板。然后将板离心一分钟，将液体收集在井底。接下来，对PCR仪进行编程，使其接受快速96孔块类型，实验类型设置为标准曲线。

将试剂设置为 TaqMan 试剂，然后选择标准运行特性。定义基因靶标和报告染料。然后定义要测试的每个反应的样品名称，并将目标和样品分配给板布局。

现在，将循环程序输入仪器。将板以正确的方向转移到实时荧光定量qPCR仪上，然后按运行键启动循环。选择文件位置以保存实验数据。

然后检查qPCR程序提供的扩增图。开发的两种试剂盒能够成功地同时扩增所有三个靶基因，每次反应的RNA拷贝低至10个。所有病毒滴定的扩增效率均高于99%