Extracellular Vesicle Tissue Factor Assay with Blood Plasma Derived Extracellular Vesicles

首先，在 37 摄氏度下解冻分离的血浆样本。将每个血浆样品的 100 微升转移到 1.5 毫升管中。向每个试管中加入一毫升无钙HBSA缓冲液。

将样品以20,000g离心15分钟，温度为4摄氏度。将上清液吸至20微升，而不干扰沉淀。接下来，向每个试管中加入一毫升无钙HBSA缓冲液。

然后上下移液以重新配制沉淀。涡旋每个管几秒钟，以确保细胞外囊泡的均匀分布。然后在4摄氏度下以20,000g离心15分钟。

再次，在不干扰沉淀的情况下将上清液吸入 20 微升。然后将沉淀在 80 微升无钙 HBSA 缓冲液中重新配制。上下移液悬浮液以获得均匀的悬浮液。

为了测量细胞外囊泡组织因子活性，首先，将 40 μL 细胞外囊泡样品移液到 96 孔板的两个孔中。在第一个孔中，加入11微升抑制性小鼠抗人TF IgG。向另一个孔中加入11微升对照小鼠IgG。

孵育后，向每个孔中加入50微升因子混合溶液。用薄膜覆盖板，然后在 37 摄氏度下孵育板两个小时。加入 25 微升 HBSA EDTA 缓冲液以阻止因子 Xa 的产生。

在蒸馏水中将显色底物复溶至4毫摩尔的浓度。现在向每个孔中加入 25 微升显色底物。用薄膜盖住盘子，然后用铝箔包裹。

将板在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。接下来，将板以1,500g离心一分钟以除去任何气泡。然后将板放在 405 纳米的酶标仪中。

使用用再生重组组织因子生成的标准曲线来转换每个孔的因子 Xa 生成。然后计算组织因子依赖性因子 Xa 的产生。11 名供体中有 6 名是中高脂多糖反应者，而 11 名供体中有 5 名是低脂多糖反应者。