牺牲鼠标后，将其放在泡沫表面上，并用胶带或大头针固定前肢。使用手术剪刀将双后肢剪到膝盖上方。将每个后肢转移到单独的解剖室中，并加入冷的Tyrode溶液以覆盖组织。
将第一后肢固定在解剖室上，确保腿部的后表面可见。在放大镜下，去除皮肤，然后暴露并切除趾短屈肌或FDB肌肉。将FDB肌肉储存在装有一毫升Tyrode溶液的标记玻璃小瓶中。
用细剪刀分离腓肠肌，然后切除比目鱼肌。从腿的前表面取下皮肤。然后，识别胫骨前肌的远端肌腱和踝关节区域的趾长伸肌或 EDL 肌。
取出并丢弃胫骨。然后，切开EDL的远端肌腱并继续解剖以完全去除EDL肌肉。在识别拇长伸肌或EHL肌后，开始沿着肌腱解剖到第一个手指。
接下来，识别并跟随腓骨最外侧的肌腱将其切断并切除腓骨长肌或 PL 肌。识别肌腱并将其追踪到第四指。然后，切割并切除腓骨趾四肢肌或 PDQA 肌肉。
解剖第二后肢后，将相同类型的肌肉收集在装有Tyrode溶液的标记玻璃瓶中。在解剖室中更换Tyrode溶液以去除碎屑和小鼠皮毛。将 PL 肌肉倒入解剖室并验证它们的完整性和收缩性。
沿着中央肌腱对比目鱼肌进行纵向或对角线切割，切割其长度的约 80%。对于EDL肌肉，沿着一根或两条肌腱，切成与比目鱼肌大致相同的长度。将每对肌肉转移到含有三毫克2型胶原酶解离溶液的新玻璃瓶中，并将它们在37摄氏度的水浴中孵育65至90分钟，轻轻摇晃。
孵育65分钟后，每五分钟在立体镜下检查小瓶。一旦肌肉出现波纹和松弛，纤维开始脱落，在室温下用酪氨酸冲洗肌肉，以失活并去除胶原酶。使用一组经过火焰抛光的巴斯德移液管，用五毫米吸头移液管搅拌肌肉周围的溶液。
然后，轻轻地将肌肉拉入和拉出尖端三到四次。当肌肉开始释放纤维并变薄时，使用四毫米的尖端重复该过程以分离更多纤维。
