首先，使用特异性引物 515f 和 806r 扩增 16S rNA 基因的 V4 高变区。使用给定条件进行PCR。接下来，向试管中加入 3.5 μL 测序缓冲液和 1.5 μL 酶混合物。
混合和旋转样品后，设置热循环仪反应。现在，将接头连接混合物加入试管中，并在 20 摄氏度下在热循环仪中孵育 15 分钟。在连接混合物中加入 1.5 微升尿嘧啶特异性延伸试剂酶，并在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。
现在，将 43.5 微升磁珠添加到接头连接 DNA 中并混合 20 次。五分钟后，将试管放入磁架中五至10分钟进行珠子分离，然后弃去上清液。用 100 微升 80% 乙醇洗涤沉淀，并将珠子干燥 30 秒。
为了在沉淀中洗脱珠子，将 8.5 微升 10 毫摩尔 Tris HCl 加入试管中并孵育两分钟。将试管放在磁性架中，并将 7.5 微升逃避的 DNA 作为上清液取出到新试管中。将 PCR 试剂添加到含有接头连接的 DNA 管中，以建立 25 微升反应。
要清洁扩增的 DNA，将 22.5 微升磁珠加入试管中并混合 20 次。五分钟后，除去50微升上清液，用100微升80%乙醇洗涤珠子。将深棕色珠子重悬于16微升水中，混合20次。
将试管放入磁架中 30 至 60 秒，然后将 15 微升转移到新试管中。混合 90 微升缓冲液、1 微升染料和 2 微升 DNA 文库样品，并在荧光仪上读取 DNA 浓度。将DNA稀释至两纳摩尔后，加载27至30微升流通池并将其放入测序仪中。
保存从音序器获取的 FASTQ 文件。单击以打开电子表格文件并创建映射或元数据文件。打开 Nephele 网站，上传 FASTQ 文件，然后阅读 QC 结束 QIIME2，执行过滤和修剪。
接下来，使用 DADA2 执行解复用双端读取、滤波器替换、嵌合体错误和合并。使用在 Silva 版本 132 99% 操作分类单元或 OTU 数据库上训练的朴素贝叶斯分类器，以 97% 的相似度执行细菌分类分配。打开 MicrobiomeDB 网站。
单击以上传文件，并生成 OTU α 多样性、β 多样性、相对丰度和稀有度曲线。最后，打开电子表格并传输数据以制作热图、维恩图和线性判别分析效应大小。基于葡萄酒酿造不同阶段细菌相对丰度的热图显示了变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和梭杆菌门等门的优势。
在属水平上，鉴定了肠杆菌科和乳杆菌科等重要属。维恩图分析显示，从葡萄汁到最终葡萄酒，有 15 个共享的独特 OTU。基于V4变区的扩增子测序结果也表明，在发酵过程中，两种traminette R和L.Beta多样性分析的α多样性表明细菌发生了变化，但最终葡萄酒中的细菌组成与葡萄汁和酵母添加阶段的细菌组成相似。
