首先，对从美国农业部检查的肉店获得的去核眼睛进行消毒和解剖，以准备眼罩。轻轻地将眼罩（内部朝上）放入装有细胞过滤器的培养皿中。将冷却的 DPBS 添加到眼罩中，确保液位刚好低于切口的最低点。
在手电筒下，找到神经视网膜开始与视网膜色素上皮分离的任何区域，然后用钝镊子轻轻抓住抬起的神经视网膜并将其剥离。轻轻收集视盘附近的神经视网膜。使用连接到真空抽吸系统的牧草移液器，吸出神经视网膜。
小心地添加额外的冷却 DPBS 以更换吸气体积。现在，吸出这个添加的 DPBS 以去除任何剩余的神经视网膜。从所有眼罩上取下神经视网膜后，轻轻地将胰蛋白酶添加到每个眼罩中，并更换培养皿盖。
用胰蛋白酶在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育眼睛30分钟。在手电筒下，使用一千微升移液管轻轻去除每个眼罩上的视网膜色素上皮细胞。将移出的细胞转移到 15 毫升离心管中。
用细胞培养基清洗眼罩以收集任何剩余的细胞并中和胰蛋白酶。将这些含有培养基的细胞与先前收集的细胞混合。在室温下以250G离心细胞悬浮液5分钟。
然后，在不破坏细胞沉淀的情况下除去上清液。将每个细胞沉淀重悬于三毫升 D 酸酶工作溶液中。将细胞悬液在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳一起孵育 15 分钟。
然后，在室温下以150G离心5分钟。除去上清液并将细胞沉淀重悬于三毫升新鲜细胞培养基中。将两个到三个眼睛的细胞转移到一个六孔板的一个孔中，并将其视为传代零。
然后，小心地将接种的六孔板转移到37摄氏度和5%二氧化碳的加湿培养箱中。从猪眼中分离出原发性视网膜色素上皮细胞，分离后三天明显出现特征性色素沉着。细胞在一周后达到完全融合，表明健康的单层。
表现出异常形态和过度色素沉着的培养物被识别为受污染，未用于实验。
