首先，取用荧光团偶联的 EV-microRNA 和细胞 microRNA 转染的 Calu6 细胞。通过圆底聚苯乙烯FACS管随附的35微米过滤器盖过滤细胞悬浮液。然后设置流式细胞仪，打开流式细胞仪，让它预热30分钟后再使用。
用鞘液灌注流体系统。之后，验证并调整激光对准。为了进行质量控制，将超纯过滤水装入流式细胞仪并以适当的流速运行，以确保足够的采集时间。
然后设置从 FSC 5， 000 处捕获 Calu6 细胞信号的阈值。为了解释荧光团之间的光谱重叠，使用未转染的细胞和仅转染一个荧光团的细胞制备补偿对照。使用分别设置为 258、192、269 和 423 电压单位的 FSC、SSC、FITC 和 PE 通道在转染细胞中进行表达分析。
然后将阴性对照样品引入流式细胞仪。在自定义工作表中定义 FSC 和 SSC 强度后捕获电池信号。在图中，X 轴选择 FSC，Y 轴选择 SSC。
在感兴趣的人口周围绘制一个多边形，以在轴上创建一个门。要使用门控总体创建新图，请将 X 轴设置为荧光信号 1。用于细胞-microRNA检测和Y轴-荧光信号2用于EV-microRNA检测。
使用独立转染每个荧光标记的microRNA的细胞，为单个荧光团建立补偿参数。对转染细胞-microRNA和EV-microRNA的细胞进行流式细胞术分析显示，对应于EV-microRNA的荧光信号连续减少。相反，与细胞-microRNA相对应的信号保留在细胞中，表明荧光团不影响细胞对microRNA的保留。
