首先，确保在光学工作台的表面上准备显微镜布局，并准确测量所有距离。然后将激发激光器安装在桌子上。将两个光圈设置为激光的预期高度，并使用这些光圈确保光束水平且居中。
将平移级（TS1）放置在镜像1或M1的位置下。使用设置为精确高度的一对虹膜来定义所需的出射光束路径，并指导每个反射元件的放置和对齐。接下来，将 M1 放在 TS1 的顶部。然后将二向色镜安装并对准工作台。
同样，安装振镜并将其与虹膜对齐。对齐完成后，定位 M2 然后将 M3 夹在桌子上。调整高度和位置，直到光束大致位于两个磨砂玻璃对准盘的中心。
然后向 M3 添加支持。接下来，开始将镜头 1 安装在桌子上。调整倾斜度和横向位置，直到光束位于 M3 上方的磨砂玻璃板上。定位透镜 2 并通过使用镜子将光束反射到远处的表面上来检查准直。
使用索引卡或目标跟踪光束，并确保光束的大小不会改变。然后用XY支架调整针孔的x、y位置，用一维载物台调整轴向距离，以最大限度地提高传输率。轴向调整透镜 4 以将激发光束聚焦在振镜表面上，并将透镜 3 排列在工作台上，然后是 SL1。
调整 SL1 的轴距以形成带有透镜 4 的共轴望远镜，然后将 TL1 平行于 SL1 放置。调整笼子系统上物镜 1 的高度，直到梁在天花板上形成一个通风盘。然后继续调整，直到光盘的尺寸最小化。
将方形反射镜放在物镜 1 的样品台上，并轴向调整反射镜，直到二向色后光束轮廓的尺寸最小化。通过将保持架杆滑入两个保持架板的空孔中来安装对准激光器。使用一个运动镜支架和一个下拉镜来对准和激发光束的路径。
将方形反射镜轴向放置在物镜 1 的样品台上，以最小化二向色后的光束轮廓。将 SL2 和 TL2 插入各自距离的发射路径中。调整物镜 2 的 XY 旋钮和倾斜度，使红色对准光束穿过光圈和磨砂玻璃盘。
调整平移级 2，直到光束在表面上形成一个小的通风盘，然后继续调整平移级 2 以最小化通风盘的尺寸。要优化变体扫描中倾斜的振镜，请按波形发生器上的 FSK 按钮为振镜选择三角波信号并将其设置为低频，例如 1 赫兹。观察同一远处表面或墙壁上的对准梁。
将物镜 3 以 0 度角安装在物镜 2 前方约 4-5 毫米处，并调整高度以匹配。将磨砂玻璃对准盘放置在用尺子测量的 SL2 和 TL2 之间的共享焦平面中。一旦发射光充满 O3 的后孔径，将磨砂玻璃圆盘安装在相机传感器的粗糙位置，并将圆盘的中心与离开 O3 的发射光对齐。将 TL3 放在物镜 3 后面，并调整倾斜度以将出射光与磨砂玻璃盘对齐。
将相机放置在距镜筒透镜的测量距离处，并从笼式平移台轴向调整物镜 3，直到孔聚焦在相机上。使用桌子上的线条作为指导，与物镜 2 的光轴成 30 度角重新调整物镜 3。在相同的轴向高度重新安装正栅测试目标，并用明场光照亮栅格。
在屏幕上水平扫描视野的焦点部分，同时网格方块保持统一大小。要对齐倾斜光片，请放置柱面透镜或 CL，以便光束聚焦到 CL3 焦平面处的水平片轮廓中。在 CL3 和镜头 3 之间的焦平面处以垂直方向插入并放置狭缝。
在相机传感器处，确认 0 度光片看起来很薄且垂直。使用电动平移载物台控制，将 M1 平移到柱面透镜上，使光片成一定角度。将预先制备的罗丹明标记的微管测试样品插入样品台并轴向调整，使染料在视场中心和屏幕右侧之间的五个不同深度处被光片照亮。
然后保存每张图片。在斐济打开图像。对于每张图像，使用“线条”工具绘制一条从视野中心到光片中心的水平线。
然后转到“分析”，然后转到“绘制轮廓”以计算 01 上方光片的角度。校准仪器后，安装预先准备好的三维磁珠样品，然后单击函数发生器上的FSK按钮设置三角波。要找到样本，请使用函数发生器设置从 20 兆赫频率、400 毫伏峰峰值幅度和 0.4 偏移开始的参数。
手动滚动 Z，直到到达采样平面并优化 Z 设置。在微管理器程序中，选择曝光时间并打开多维采集窗口。将间隔设置为 30，然后使用计数框选择帧数。
设置参数后，记录一次卷完整扫描的时间间隔。重组微管网络的体积扫描显示，三维结构向中心致密，产生明亮的荧光区域。在盖玻片附近的成像平面中，共聚焦显微镜分辨出Astar外围的单丝，由于来自上方的失焦荧光信号，朝向中心的额外背景。
然而，由于 Astar 的失焦密集部分，在 Z 轴上移动几微米会迅速降低图像质量。光片的单平面照明消除了失焦信号，使平面之间的图像质量相当。
