首先，重悬合成的肽，该肽在DMSO中浓度为0.1毫克/毫升，作为阳性对照。将重悬肽与生物素化组蛋白 H4 肽混合以创建标准曲线。接下来，将乙酰化反应一式两份组装在96孔PCR板中。
20 微升反应应包括 10 微升酶、1 微升 H4 肽、1 微升 20X 缓冲液和 1 微升 DTT。向每个孔中加入一微升DMSO或测试化合物。轻轻移液混合混合物。
然后将混合物在冰上孵育 10 分钟，以允许酶抑制剂络合。为了继续乙酰化反应，将两微升 4-戊烯油辅酶 A 与四微升水混合。将六微升这种混合物加入孔中。
轻轻混合后，在室温下以300G离心混合物30秒。将内容物在 37 摄氏度下在带盖的试管中孵育一小时。用 20 微升八摩尔尿素淬火内容物，并在零下 20 摄氏度下储存，直到进一步加工。
接下来，将 80 μL PBST 移液到 BSA 预封闭的黑色 NeutrAvidin 包被的 96 孔板的每个孔中。将40μL反应内容物加入板的孔中。然后将标准曲线肽一式两份移液到剩余的孔中。
在室温下在轨道振荡器上轻轻搅拌肽一小时，以促进结合。结合完成后，从孔中吸出液体。使用洗板机用 200 微升 PBST 清洗孔。
对于点击反应，将THPTA铜混合物加入水中的抗坏血酸钠和DMSO中的生物素叠氮化物中。将 19 μL 新鲜混合的试剂分配到每个孔中。用铝箔密封板。
然后在 37 摄氏度下孵育一小时。像以前一样洗涤之前从孔中抽出溶液。接下来，向每个孔中加入 100 μL 稀释的链霉亲和素辣根过氧化物酶混合物。
在室温下孵育一小时，在轨道振荡器上轻轻搅拌。为了混合 Amplex Red 检测试剂，将 500 μL 稀释的过氧化氢移液到 Amplex Red 试剂中。将 50 微升这种混合物加入 4.5 毫升磷酸钠中。
将 100 微升 Amplex Red 反应混合物移液到洗涤的孔中。然后将板在室温下孵育 30 分钟，远离光线。启动 SmartControl 软件，然后单击 Plate Out。
将板转移到仪器中后，单击 Amplex Red 图标并更改板布局。再次按 Amplex Red 图标可查看更改的布局。然后从布局中选择左上角的标准孔。
更改文件名，然后按下“开始调整”。设置增益后，单击“开始测量”。按当前状态观察实时测量。
测量结束后，关闭选项卡。然后单击顶部面板上的“打开上次运行”。导航到 Mars 选项卡。
然后按 导出到 Excel 从主菜单导出数据结果。观察到化合物 A 和 C 在多次稀释时抑制 HAT1 活性近 100%。
