用于蛋白质印迹的细胞培养和细胞热位移测定 （CETSA） 样品制备

首先，将原始 264.7 细胞加入 100 毫米培养皿中，并在 37 摄氏度、95% 湿度和 5% 二氧化碳下与 6 毫升 DMEM 孵育。一旦细胞达到 80% 汇合度，吸出旧培养基，然后用加热至室温的 2 毫升 PBS 洗涤细胞两次。接下来，向每个含有细胞的培养皿中加入两毫升 PBS 并混合它们。

将细胞收集到两个 1.5 毫升微量离心管中，然后在室温下以 377 G 离心 3 分钟。丢弃上清液后，将细胞重悬于两毫升PBS中。现在，将微量离心管在液氮中冷冻，直到形成白色固体，并立即在 37 摄氏度的水浴中解冻。

将试管以 12， 000 G 在 4 摄氏度下离心 10 分钟。接下来，取两个微量离心管，一个装有100微摩尔的Xanthatin，另一个装有等体积的二甲基亚砜。向每个试管中加入 450 微升离心上清液，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。

然后将 60 微升上清液从每个微量离心管转移到 14 个 PCR 管中。在不同的温度下同时加热试管三分钟，每个温度下有两个PCR管。然后将试管放入离心机中。

现在，从每个试管中取出 48 微升上清液，并将其添加到新的 1.5 毫升微量离心管中。向每个试管中加入 12 微升 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液。在 100 摄氏度的水浴中加热涡旋样品 5 分钟。