要开始培养光滑念珠菌,请将所有实验材料放在工作平台上。从酵母蛋白胨葡萄糖或 YPD 琼脂平板中挑选单个 C.glabrata 菌落。并将其转移到含有 3 毫升 YPD 培养基的玻璃试管中。
在 25 摄氏度下孵育 14 至 16 小时,以 155 RPM 的速度振荡。孵育后,在新鲜 YPD 中稀释培养物,以获得 600 纳米的光密度为 0.1。将稀释的培养物在 25 摄氏度下孵育 6 小时,以 155 RPM 振荡。
制备酵母悬浮液,光密度为600纳米,为0.1,在YPD至3毫升。加入 30 微升溴化乙锭原液,将酵母悬浮液在 25 摄氏度、155 RPM 和 45 度角下孵育过夜。第二天,用新鲜的YPD培养基将培养物的光密度调节至0.65。
在 96 孔板中,将 20 微升酵母悬浮液添加到每孔 180 微升 PBS 中,以稀释 10 倍。将每种稀释液 20 微升板放在 YPD 琼脂板的四个象限上。将板在 37 摄氏度下孵育过夜。
第二天,选择具有 5 至 80 个菌落的象限,并加入 20 微升 20% 三苯基四氮唑。并将 20 微升 20% 三苯基氯化四氮唑直接添加到每个菌落的中心。将板在 37 摄氏度下孵育 30 至 40 分钟。
使用 48 位全彩色光学扫描仪以 1200 DPI 扫描印版。DNA 嵌入剂 Ethidium bromide 可有效诱导 C.glabrata 的小型突变体。