首先，对经过神经嵴诱导的人多能干细胞进行 12 天的培养。轻轻地从细胞中吸出培养基 C。每平方厘米孔表面积添加 100 微升 PBS 以洗涤细胞，然后去除 PBS。
向细胞中加入等体积的细胞分离溶液，并在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳补充下孵育 30 分钟。向板中加入等体积的 NCC 培养基。然后，使用血清移液管收集细胞悬液并将其转移到 15 毫升锥形管中。
在 20 至 25 摄氏度之间以 290G 离心细胞 2 分钟。小心丢弃上清液，不要干扰细胞沉淀。使用 10 毫升血清移液器将 12 毫升 NCC 培养基移液到细胞沉淀中。
机械上下移液以产生悬浮液。然后，将细胞悬液转移到超低附着板上。第 14 天，轻轻旋转细胞培养板，在每个孔的中心收集小球体。
使用 P1000 微量移液器从每个孔的圆周缓慢吸出用过的培养基。用原始体积的 NCC 培养基重新喂养细胞。第 15 天，小心去除培养基。
将 PBS 添加到孔中以洗涤球体。然后，去除尽可能多的 PBS，确保球状体不受干扰。接下来，每平方厘米孔表面积添加 100 微升细胞分离溶液。
将细胞在溶液中在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳下孵育 30 分钟。使用 10 毫升血清移液管，向每个孔中加入等体积的 ENC 培养基。机械移液溶液以破坏任何剩余的球体。
然后将细胞转移到 50 毫升锥形管中。像以前一样离心后弃去上清液。然后，将细胞重悬于 5 至 10 mL ENC 培养基中。
使用台盼蓝和血细胞计数器计数活细胞的浓度。现在，添加足够体积的 ENC 培养基，以每平方厘米表面积接种约 300， 000 至 400， 000 个活细胞，密度为每毫升约 100 万个细胞。然后，从孔中吸出溶液。
接下来，将细胞添加到带有 PO/FN 层粘连蛋白包被孔的板中。每隔一天用每平方厘米孔表面积 200 微升 ENC 培养基喂养细胞，直至第 30 至 40 天。神经嵴诱导后观察到具有光滑表面的高质量自由漂浮球体。
球体表达神经嵴标志物 SOX10。在肠道神经元诱导期间，在 25 至 30 天之间观察到神经突。
