首先，将 500x 橙色染料添加到 PBS 溶液中以获得不同的染料比例，在桌面上启动数据采集软件。单击“仪器”，然后选择相应的微孔板型号，然后选择“确定”。单击“采集”设置，然后选择“荧光”。
在波长接口下，将 lambda one 设置为 470 纳米和 570 纳米，然后按 Okay。将每种浓度的橙色染料吸取 100 微升到 96 孔板的孔中。将板放入荧光酶标仪的检测台。
单击软件上的“读取”图标，在室温下以两分钟的间隔测量每种染料浓度的荧光 13 次。每次确定后，单击“导出”图标，然后选择“导出到 XML XLS TXT”。选择所有板块。
然后在输出格式中选择 Plate，然后单击 Ok 将数据保存为 XLS 格式以供进一步分析。现在，打开数字加热摇晃干浴。将加热温度设置为 35 摄氏度，加热时间设置为两分钟。
在1.5毫升微量离心管中制备染料的最佳稀释比例。然后将其放入数字加热摇晃干浴中两分钟。现在，将 100 微升 PBS 和染色溶液加入板的孔中。
将板放入仪器的检测台中。单击数据采集软件中的读取图标。将加热温度设置为 40 摄氏度，加热时间设置为两分钟。
现在，将板中的染料溶液移回 1.5 毫升微量离心管中。在数字加热摇晃干浴中加热两分钟。重复添加染料溶液，导出所得数据以测试染料溶液在 35 至 95 摄氏度的 5 度温度增量下的吸光度。
将 CD40 蛋白溶液与 PBS 混合，获得 5、10、15 和 20 μL/μL 的终浓度。接下来，将橙子染料与PBS混合，得到终浓度为1至500。评估 CD40 蛋白溶液在 35 至 95 摄氏度的 5 度温度增量下的吸光度。
将数据另存为 XLS 文件，然后使用数据分析软件计算熔点或 TM 值。接下来，将 CD40 和 Umbelliferone 混合到 PBS 溶液中。然后将橙色染料移液到PBS中，得到溶液浓度为1至500。
在35至95摄氏度的五度温度增量下测量CD40 Umbelliferone复合物溶液的吸光度。橙色染料在室温和高温下均表现出稳定的荧光激发。最佳稀释比为1至500，确定。
在浓度为15 μg/mL时，可检测到稳定的TM值为51.82°C，随着CD40蛋白浓度的增加，TM值降至45.79°C。
