共聚焦成像和突触测量，用于分析经验依赖性关键期突触肾小球修剪

首先，取一张载玻片并在其上添加两条薄薄的双面胶带以准备成像。在两条胶带之间移液大约 10 至 15 微升的封固剂，用于脑部安装。用预 PBS 和 0.2%Triton X-100 预冲洗的 P20 移液器吸头将标记的果蝇大脑转移到显微镜载玻片上。

转移大脑后，使用细画笔对齐它们，确保触角叶朝上。确定大脑的方向后，用玻璃盖玻片盖住它们。然后，用额外的封固剂填充盖玻片的侧面。

用透明指甲油密封盖玻片的边缘。彻底干燥载玻片后，将其存放在冰箱中以备后续成像。使用配备 63 倍油浸物镜的激光扫描共聚焦显微镜进行成像。

使用氩 488 和氦氖 543 激光器对触角叶的突触肾小球和 Or42a 嗅觉感觉神经元进行成像。确定两个通道的光增益和偏移。将成像定位到大脑中心并专注于 VM7 肾小球。

大致找到大脑中间的孔。选择 1024 x 1024 的成像分辨率。通过触角叶捕获整个共聚焦 Z 堆栈投影，以确保捕获 VM7 肾小球的完整 Or42a 神经元神经支配。

将基因型或条件盲化图像加载到斐济。要拆分激光线通道，请转到图像，单击 颜色，然后选择 拆分通道.在 Or42a 嗅觉通道中，滚动 Z 堆栈以确定哪些切片包含 Or42a 神经元神经支配，从而识别荧光的开始和结束。

要创建仅包含具有 Or42a 神经元神经支配的切片的总和切片投影，请单击图像并转到 stacks。然后，单击 Z 项目，选择和切片，然后输入所需的范围。使用斐济的套索工具追踪 VM7 肾小球中 Or42a 神经元神经支配的轮廓。

将追踪区域的周长乘以 Z 堆栈切片的数量和每个切片的厚度，以计算 VM7 突触肾小球神经支配体积。暴露于对照气味载体 24 小时后，密集的 Or42a MCD：GFP 神经支配在两个触角叶的 VM7 肾小球中持续存在。相比之下，暴露于 25% EB 气味剂 24 小时会导致突触肾小球体积显着修剪和损失。

增加 EB 气味剂浓度导致突触肾小球修剪逐渐增加。该范围内的 EB 气味浓度的代表性定量显示荧光强度和神经支配体积相似的结果。