首先,选择由饥饿的 L1 期秀丽隐杆线虫幼虫占据的线虫生长培养基或 NGM 板。使用一毫升无菌水,轻轻清洗板上的蠕虫。将大约 300 μL 蠕虫种群分装到接种有浓缩 OP50 的 NGM 平板上。
使用板式干燥机或本生灯让板干燥,然后在 20 摄氏度下孵育,直到大量种群成为妊娠成虫。要收集蠕虫,请用最多 10 毫升的无菌水将它们从盘子上清洗干净,然后将温水混合物转移到 15 毫升锥形管中。让蠕虫在重力作用下在试管底部沉淀约 4 分钟。
使用小移液器吸头,小心吸出并丢弃上清液。然后加入最多 15 毫升的无菌水。最后一次洗涤后,去除上清液,加入 5 毫升新鲜制备的漂白剂和氢氧化钠溶液。
在室温下孵育蠕虫 5 分钟,同时每分钟涡旋至少 10 秒。使用解剖显微镜监测进度。一旦所有成虫都裂开或溶解,加入 M9 缓冲液以中和反应,使最终体积达到 15 毫升。
然后将试管以 1, 300 G 离心 2 分钟,用 13 毫升 M9 缓冲液离心再洗涤鸡蛋两次,然后用 15 毫升 S 完全缓冲液洗涤一次。然后以 1, 300 G 离心鸡蛋 2 分钟,离心后,吸出上清液并加入 10 毫升 S 完全缓冲液。使用突变器或类似设备在室温下轻轻旋转管过夜。
使用解剖显微镜评估蠕虫是否已经孵化。在显微镜下对 10 微升 S 缓冲液中的蠕虫进行计数。在含有羧苄青霉素、两性霉素 B 和 OP50 的 S 完全培养基中制备每毫升 60 条蠕虫的液体蠕虫混合物。
将 120 微升含蠕虫培养基加入 A 至 G 行,将无蠕虫培养基加入 H 行,然后用胶带密封剂密封板,以防止污染和蒸发。将密封板在 20 摄氏度下孵育约 65 小时,直到动物变成 L4 蠕虫。向每个孔中加入 30 微升 0.6 毫摩尔氟脱氧尿嘧啶原液,以对 L4 阶段的动物进行绝育。
使用胶带密封剂重新密封板,并在微量滴定板振荡器上以 800 RPM 的转速搅拌 20 分钟。将板放回 20 摄氏度的培养箱中。第二天,将感兴趣的药物添加到第一天培养物中。
用胶带密封剂重新密封板,并在板振荡器上以 800 RPM 的速度摇动 20 分钟。然后,在取下盖子和密封件后,在读板器中测量 OD 600 以进行第一天的测量。重新密封板并将其放回 20 摄氏度的培养箱中。
使用倒置显微镜,最好是两倍物镜,计算每个孔中的蠕虫种群,并将数字记录在电子表格中。计数后,将板放回 20 摄氏度的培养箱中。剂量反应曲线是食物摄入量与血清素浓度的完全变化,表明 N2 菌株可以以剂量依赖性方式暴饮暴食。
daf-16 mu86 突变体表现出比 N2 更高的基础摄食。然而,它不能像 N2 菌株那样以剂量依赖性方式对 5-羟色胺做出反应。观察到用洛沙平处理但以被 X 射线、伽马射线或多聚甲醛杀死的细菌为食的蠕虫的食物摄入量存在显着差异。对一系列遗传菌株的食物摄入量比较表明,exc-4 和 cgr-1 突变体吃得更少,而 srp-6 突变体吃得更多。