为了执行基于CRISPR的模块化组装或CRISPRmass的平行两步试管反应,继续在试管反应步骤1中通过Cas9 sgRNA切割cDNA / ORF质粒的相同载体骨架。为此,将正确标记的 0.2 毫升管放置在冰上的铝制冷却块中。通过混合适量的Cas9,sgRNA,Cas9缓冲液和DEPC处理过的水,制备N次反应的预混液。
将预混液的组分加在一起后,涡旋相同的成分以确保正确混合。然后将混合物旋转并分装两微升预混液到每个 0.2 毫升管中。接下来,向每个试管中加入 0.4 微升 0.019 微摩尔 cDNA/ORF 质粒。
在 37 摄氏度下孵育裂解反应一小时。在接下来的试管反应第二步中,继续将载体特异性 UAS 模块插入所得的 Cas9 线性化 cDNA/ORF 质粒中。为了为每个样品设置1.4微升的单步反应,将标记的0.2毫升管布置在冰上的铝冷却块中。
通过混合适量的UAS模块和单步反应组装预混液,制备N次反应的预混液。在旋转混合物之前,将混合物充分涡旋。然后将 0.77 微升预混液分装到每个管中。
将 0.7 微升 Cas9 线性化 cDNA/ORF 质粒添加到每管的等分试样中,并在 50 摄氏度下孵育反应 1 小时。