首先,获得分化的 THP-1 细胞并从培养板的孔中取出用过的培养基 用 PBS 洗涤细胞后,向细胞中加入含有脂多糖或 LPS 的无血清培养基并孵育板。然后将三磷酸腺苷或ATP储备溶液加入模型组中,并将板在37摄氏度下与5%二氧化碳孵育45分钟。接下来,从培养板的孔中吸出所有上清液。
用 PBS 洗涤细胞两次后,向每个孔中加入 500 微升不含 EDTA 的 0.05% 胰蛋白酶,并孵育 30 秒。为了阻止细胞脱离,加入 1 毫升 RPMI 1640 培养基并将细胞转移到 5 毫升管中。在室温下以 300 G 离心管 3 分钟。
将细胞重新悬浮于一毫升 PBS 中后,将装有细胞的试管置于 37 摄氏度的水浴中三分钟并离心。为了重新悬浮细胞,加入 100 微升 1X 结合缓冲液并将细胞转移到新的 5 毫升管中。在室温下用适当的试剂在黑暗中孵育对照管和模型管。
要终止孵育,请向试管中加入 400 微升 PBS 并轻轻涡旋。在固定在5毫升聚苯乙烯圆底管上的35微米尼龙网中过滤细胞悬浮液。将干净的盖玻片浸入铬明矾溶液中两个小时,然后在 37 摄氏度的烤箱中干燥。
如前所述,将胰蛋白酶消化的细胞沉淀,并用 500 微升电子显微镜固定剂在室温下固定细胞 2 小时,然后在 4 摄氏度下孵育过夜。从固定溶液中收集细胞后,在室温下以 300 G 沉淀 3 分钟。加入 100 微升 PBS,轻轻吹走细胞。
将细胞悬浮液滴到盖玻片上,静置五分钟。吸出所有上清液,用PBS洗涤细胞三次,每次5分钟。加入 500 微升 1% 锇酸固定液。
一小时后,吸出所有上清液。三次PBS洗涤后,将样品在浓度增加的乙醇中脱水。打开临界点干燥器,打开二氧化碳罐,将腔室冷却至 10 摄氏度。
快速用滤纸包裹样品,当腔室压力为每平方英寸零磅时,将其放入腔室中。一旦温度稳定到 35 摄氏度,压力达到 1, 250 磅/平方英寸,以每分钟每平方英寸 100 磅的速度减压。当腔室压力为零时取出样品。
最后,使用导电胶带将样品安装在扫描电子显微镜上,铝样品架采用溅射打码器。用 2 到 5 纳米的金层覆盖样品。流式细胞术分析显示,LPS/ATP刺激后,QT区的细胞显著增加,提示细胞死亡。
质膜表面扫描电镜照片显示细胞焦亡特征,包括LPS/ATP刺激细胞的膜起泡和破裂,而对照细胞看起来正常。此外,LPS/ATP刺激导致细胞出现膜起泡、细胞收缩等凋亡特性,并观察到细胞出现细胞肿胀、膜破裂等坏死性凋亡特征。