在转染原代海马神经元两天后准备使用共聚焦显微镜进行成像。将活细胞室附件加热 60 倍主观油和透镜油至 37 摄氏度，并将腔室平衡至 5%CO 2 。使用目镜，识别含有货物蛋白的通道中的转染神经元。
接下来，单击扫描对神经元进行成像并识别 SCI-5 通道的轴突初始片段。将视野设置为 32 x 128 像素的矩形框，并移动它以对轴突初始段远端 50 至 150 微米的轴突区域进行成像。记录货物运输的方向性和 ROI 的方向，然后按 save as 将其保存为文件。
请注意，框上的点将出现在后续图像的顶部和右侧。记录图像中最靠近细胞体的一侧和最靠近轴突末端的一侧，以确保 comagraph Polyline 的正确方向。将 561 激光功率设置为 1.40，将针孔设置为 7.8，将大小设置为 128 像素正方形，将速度设置为每秒 32 帧。
调整增益以可视化单个货物囊泡的运输，而不会被背景信号遮挡。从 ROI 下拉菜单中选择 draw rectangular ROI 并绘制 ROI，使其覆盖整个视野。然后右键单击并选择 use as stimulation ROI S1。然后在 ND 设置选项卡中，单击获取图像以收集刺激前参考图像。
然后将刺激设置为 ROI S1，将间隔设置为无延迟，持续时间为 1.64 秒，循环次数为 7。然后单击 acquire image 以收集刺激后参考图像。选择等待、无采集、两分钟，为荧光货物提供恢复期，以重新填充漂白后的 ROI。
选择采集间隔、无延迟、持续时间 5 分钟、循环、8、615。单击 ND 设置选项卡上的 apply stimulation settings 按钮，然后单击 run now 立即运行。还可以从两个神经元收集运输视频进行分析。
将视野重置为整个图像，然后在 561 和 647 通道中收集完整神经元的图像，其中包括 ROI 框。记录拍摄图像的 XY 坐标，用于固定后确认蛋白质表达。使用该方案对表达转运蛋白 mAPL 突触素的转染神经元进行活细胞成像。
Axon 初始段中神经 fasin 的外部结构域也被标记。在感兴趣的轴突区域进行货物运输的成像。进一步的成像后免疫荧光分析证实了 tau 蛋白和 mAPL 突触素的共表达。
