从小鼠中分离和切片骨组织以进行转录组学研究

首先，用70%乙醇喷洒小鼠皮肤。然后，使用无菌解剖剪刀，打开皮肤，露出腿部肌肉。切开腿部旁边的肌肉，以清楚地看到骨头，然后轻轻地去除骨头，而不会损坏它。

立即将骨头放入含有 4% 三聚甲醛的管子中，然后将管子放在冰上。收集所有骨样本后，将试管在 4 摄氏度的冷藏室中置于轨道振荡器上至少 24 小时。固定后，从轨道振荡器中取出骨组织，并用1X PBS洗涤两次，每次3分钟。

然后，使用无菌解剖剪刀去除附着在骨头上的任何剩余肌肉。再次用 1X PBS 清洗骨头三分钟。将骨头放入含有 20% DDTA 的新容器中，pH 值为 8，并在室温下以 140 RPM 在轨道振荡器上孵育 30 分钟。

然后，用新鲜的 20% DDTA 替换 EDTA 溶液，并重复搅拌 30 分钟。在最终的EDTA处理后，加入新鲜的EDTA，并将容器在4摄氏度的轨道振荡器上孵育过夜。接下来，从EDTA容器中取出样品，并用1X PBS洗涤两次，以去除EDTA残留物。

通过将骨头置于 70% 乙醇中以 140 RPM 孵育 15 分钟来开始脱水过程。然后，弃去70%乙醇溶液，加入90%乙醇溶液。以 140 RPM 孵育 15 分钟。

接下来，通过将脱水的骨组织放入装有二甲苯的新容器中来开始清除过程。以 140 RPM 孵育 20 分钟。用新鲜的二甲苯替换用过的二甲苯，然后再孵育 20 分钟。

接下来，将清除的骨头样本放入包埋盒中并开始蜡渗透。在 60 摄氏度下孵育 30 分钟。丢弃用过的蜡，加入新蜡，然后再孵育 30 分钟。

然后，更换蜡并再孵育 45 分钟。小心地将骨头以所需的方向放置在模具中。让蜡在冷表面上凝固。

将块存放在 4 摄氏度直至切片。接下来，准备用于切片的设备。用去污溶液喷洒所有工作表面和仪器，以去除 RNase。

另外，设置一个用 42 摄氏度的双蒸水制成的水浴。用 70% 乙醇清洁切片机刀片以去除油，然后去污以去除 RNase。将刀片固定在切片机上，并确保间隙角设置为 10 度。

用去污溶液喷洒镊子、刷子和探针，并将它们存放在一个冰桶中。通过在另一个冰桶中加入双蒸水来准备冰浴。通过将FFPE块放在切片机上来开始切片过程。

将切片机设置为修剪或设置卷轴厚度为 14 微米。开始修剪样品并继续，直到组织可见。通过将 FFPE 块放在冰浴上来水合。

将水合样品固定在切片机样品夹中，将其与刀片对齐，并将涡旋厚度设置为五微米。开始切片组织。用冷镊子和刷子收集切片的组织，并将其置于 42 摄氏度的水浴中。

将组织放在载玻片上，在 42 摄氏度下孵育 3 小时。将载玻片在室温下的烤箱中干燥过夜。将准备好的载玻片在室温下存放在载玻片盒中。

使用这种方法，从镜像股骨中制备去矿化FFPE骨样品。通过比较未脱钙的股骨和脱钙的股骨3小时和24小时，优化了脱钙时间进程。H 和 E 染色结果显示，较短的脱钙时间会导致切片断裂和损伤，而 24 小时染色过程可产生更好的组织学质量。

使用 RNA 片段分布值 DV200 进行 RNA 质量评估显示，脱钙样品的 DV200 分数保持在 50% 以上，适用于SCRNAC或空间转录组学等分析。然而，延长孵育时间会导致 RNA 完整性下降，因此不推荐使用。