首先将细胞外基质包被在细胞培养小室上，用于类器官衍生的 2D 单层培养。将 100 微升细胞外基质涂层涂在每个准备好的细胞培养小室的顶腔上，然后盖上盖子。然后将细胞培养板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的加湿培养箱中孵育 1 小时。
对于直肠类器官细胞，孵育后，用直肠单层培养基替换细胞外基质涂层并孵育过夜。在酶消化类器官并过滤成单个细胞后，将细胞悬液在 4 摄氏度下以 200 g 离心 5 分钟，然后丢弃上清液。接下来，在单层培养基中为每个细胞培养小室制备 200 微升细胞悬液。
检索含有细胞外基质包被的细胞培养小室的 24 孔细胞培养板。使用真空抽吸，小心地清空每个细胞培养小室的顶腔，以避免破坏涂层。小心地将 200 μL 的单细胞悬液涂抹到每个细胞培养插入物的顶端腔室中。
将 500 微升适当补充的单层培养基添加到每个孔的基底外侧腔中。然后将板在加湿培养箱中孵育，以促进细胞粘附和生长，在细胞培养小室上形成汇合的 2D 单层。从细胞接种后 48 小时开始，每隔一天更换一次顶端和基底外侧腔中的培养基。
对于类器官来源的 2D 单层的免疫荧光染色，用手术刀刀片小心地切出细胞培养插入膜，并将细胞培养插入物放在载玻片上。在观察细胞之前，将安装介质添加到盖玻片上并将其放在载玻片上。将解离的成熟类器官接种到细胞培养小室上一天后，似乎形成了 2D 单层。
扫描电子显微镜显示接种后 5 天在 2D 单层的顶端表面有发达的微绒毛和细胞分界。2D 单层的免疫荧光染色证实，在回肠和直肠类器官衍生的 2D 单层中存在顶端刷状边界、基底外侧粘附连接和产生粘液的杯状细胞。
