从斑马鱼卵巢中分离颗粒无细胞 I 期卵母细胞

首先，将斑马鱼切除的卵巢转移到含有 2 毫升细胞解离溶液的六孔板中。将卵巢在 28.5 摄氏度下孵育 2 到 3 小时。向缓冲液中加入 2 至 3 mL 预热的 L15 培养基以停止消化。

接下来，将 70 微米的细胞过滤器放入 6 孔板的另一个孔中。向孔中加入 L15 培养基，确保培养基水平高于过滤器。现在，使用移液器将消化培养基吸过细胞过滤器。

用移液管去除多余的培养基。向孔中加入 4 毫升新鲜的 L15 培养基，轻轻重悬卵母细胞。几分钟后，吸出上清液。

要选择用于质量控制的卵母细胞，请将它们转移到含有新鲜 L15 培养基的 35 毫米宽的培养皿中。在光学显微镜下使用 10 倍或更高的放大倍率观察卵母细胞。使用钝器注射工具去除任何细胞碎片、第一阶段卵母细胞或任何其他阶段的卵母细胞。

为了确认生长阶段，将 Hoechst 33342 添加到含有卵母细胞的 L15 培养基中并孵育。在紫外激光激发下用荧光显微镜观察卵母细胞。用针头小心挑选出不符合所需标准的卵母细胞。

幼年卵巢显示出丰富的透明 1 期卵母细胞，伴有较小的 2 期卵母细胞群。成年鱼卵巢以不透明的晚期 2 至 3 卵母细胞为主。参考方法导致卵母细胞表面有许多染色的颗粒细胞核，密集地包裹着卵母细胞。

相比之下，修改后的方法允许分离没有颗粒细胞核染色的第一阶段卵母细胞。