Monochamus alternatus 真菌病原体的分离和行为鉴定

收集松树锯木 Monochamus alternatus 甲虫后，将甲虫放入装有新鲜树枝的无菌管中。将甲虫饲养在 25 摄氏度的非加湿培养箱中。孵化后，记录的甲虫表现出摄食和活动能力下降。

将坚硬的死甲虫转移到湿室中。将受到真菌感染的甲虫解剖成触角、头部、胸部、腹部、翅膀和腿部等主要位置。用剪刀将每个位置的外皮剪成小块。

轻轻地将这些碎片的外表面压在含有抗生素的 PDA 板上。用封口膜密封板并在 25 摄氏度下孵育，直到组织完全被菌丝体覆盖。然后根据表型特性将单个菌落转移到新的 PDA 板上。

使用真菌基因组 DNA 分离试剂盒提取基因组 DNA。用引物 ITS1 和 ITS4 制备 PCR 混合物，以扩增 DNA 的 rDNA-ITS 区域。使用相机捕获 PDA 板正面和背面的成熟真菌纯菌落形态。

用接种针从纯真菌菌落中摘取分生孢子，并用一滴无菌水将它们转移到载玻片上。然后将盖玻片盖在标本上，不要引入气泡。用手术刀从真菌菌落的边缘切下 5 毫米的琼脂块，然后用一滴无菌水将其转移到干净的载玻片上。

使用细针，小心地将真菌与琼脂分离，以观察特定结构。在光学显微镜下，观察真菌的无性形态，包括菌丝、分生孢子、分生孢子和分生孢子的姿势。