首先，设置荧光显微镜进行成像。插入带有免疫染色组织切片的完全染色的载玻片。设置目标后，按下 live 按钮，然后专注于样本。
使用自动缩放图标来评估通道是否有足够的信号饱和。完成显微镜设置后，用单色对照玻片加载显微镜。将焦点放在样本下方，然后按 Z-Stack 菜单中的 begin 选项开始设置 Z-Stack。
然后将焦点放在样本上方并按下 end 选项。对于图像的荧光补偿，请打开其中一个对照图像。观察每个通道的灰度窗口，查看不适当通道中的信号。
要删除渗透，请手动将数字输入到矩阵中，然后按 apply 以测试它是否已被充分删除。接下来，将每个控件中的所有值组合到一个矩阵中。将此基质应用于完全染色的样品。
启动 ilastik 软件并打开组织的 tiff 文件。单击训练选项卡，然后使用画笔工具突出显示图像上的各个单元格。确保突出显示细胞，以便包括内部和细胞膜。
接下来，使用标签 2 突出显示不是感兴趣单元格的所有内容。现在启动软件 3 并打开包含所有荧光染色剂的组织的 IMS 图像。选择 mask over nuclei 选项作为细胞核检测的源通道。
然后选择按种子点分割细胞核的高级选项。设定 nucleus diameter 的值。检查图像中是否有融合的多个单元格或缺失的单元格。
然后单击创建的单元格对象，然后单击创建选项卡，然后单击存储批量参数选项以保存使用设置。启动 Anaconda，然后在 Anaconda 中启动 JupyterLab。打开补充编码文件 1，然后按 run all cells 或 run selected cells 在运行菜单中。
出现提示时，输入导出的荧光值的文件目录。然后输入适合保存已处理文件的任何位置的文件目录。运行代码的下一部分，使用每个通道的名称对数据进行注释。
建立门控策略后，右键单击菜单中的 population，然后选择 export.将参数导出为包含标题的 csv 文件。再次在 Anaconda 中启动 JupyterLab。
然后打开 Supplementary Coding file 2 中的脚本并运行代码。当提示输入软件的文件位置时，输入导出的 csv 文件的文件目录。接下来，当系统提示添加输出位置时，选择所选文件目录，并确保文件目录在末尾包含文件名。
运行代码的其余部分。现在复制 txt 文件中的文本，并在软件 3 中打开相应的 ims 文件。单击文件中的单元格对象。
切换到 statistics 选项卡，然后将文本粘贴到搜索栏中并开始搜索。现在将突出显示所有感兴趣的单元格。光谱重叠的荧光染料在用多种染料染色的组织中被有效分离。
染料的分离清楚地区分了淋巴组织中的不同细胞类型。用户定义的机器学习用于分离细胞，即使它们紧密地压在一起也是如此。
