通过慢病毒转导开发缺氧反应性 CAR-T 细胞

首先，将一小瓶冷冻保存的人外周血单核细胞放入 37 摄氏度的水浴中。解冻后，将 PBMC 悬浮液转移到含有 9 ml TGM 的 15 毫升试管中。吸取等分试样的细胞悬液进行计数后，将试管以 300 G 离心 5 分钟。

将沉淀的 PBMC 重悬于 3 毫升 TGM 中。然后，将所需体积的细胞悬液转移到六孔板中。细胞复苏前一天，将 100 μL 小鼠免疫球蛋白 G 磁珠转移到 1.5 mL微量离心管中。

向试管中加入 1 毫升 PBS，并将其放在磁力架上以洗涤珠子。将珠子重悬于 100 微升 PBS 中。然后将抗体添加到悬浮液中。

使用移液管轻轻混合悬浮液。将悬浮液放在 4 摄氏度的摇杆上过夜。如前所述在 PBS 中洗涤珠子后，将它们重悬于 100 微升 PBS 中。

现在将 NHCD3 hCD28 包被的免疫珠添加到板中并孵育。孵育 48 小时后，将细胞悬液混合并转移到 15 mL 离心管中。将试管放在磁力架上 3 分钟。

然后将上清液转移到新的 15 mL 试管中。将 5 乘以 10 的 5 次方 PBMC 在 300 微升 TGM 中接种到 48 孔平板的孔中。将 200 微升慢病毒原液移液到相应的孔中。

然后在离心前加入硫酸鱼精蛋白至终浓度为 10 μg/mL。从每个孔中吸取 300 微升上清液，然后向每个孔中加入 1 毫升新鲜 TGM。将板置于 37 摄氏度的加湿培养箱中，在 5% 二氧化碳下。

每 2 到 3 天向板中加入 0.5 至 2 毫升新鲜的 TGM。然后将细胞转移到 12 孔板中，然后转移到 6 孔板中，直到总细胞密度达到 600 万（4 毫升体积）。