CAR-T 细胞中氧依赖性 CAR 表达的流式细胞术评估

首先，将培养的 CAR 转导的 T 细胞接种到两个含有 2 毫升 TGM 的 12 孔板中。将一个板直接放入 37 摄氏度下 5% 二氧化碳的加湿培养箱中。将另一块板放入移动式二氧化碳、氧气氮培养箱中，氧气水平预设为 1%在两种条件下每 24 小时从板中收集 500， 000 个细胞，放入 1.5 毫升微量离心管中。

将试管以 500 G 离心 5 分钟。去除上清液后，轻轻吸取 1 毫升 PBS 到细胞沉淀中。将沉淀的细胞重悬于 50 微升 FACS 缓冲液中。

然后加入 50 微升 1 比 100 稀释的藻红蛋白偶联的抗旗抗体。吸取悬浮液以充分混合。孵育后，向每个试管中加入 1 毫升 FACS 缓冲液。

将混合混悬液以 500 G 离心 5 分钟。现在，从每个试管中移出上清液。然后将细胞重悬于 200 微升 FACS 缓冲液中。

将所得细胞悬液转移到 5 毫升流式细胞术管中。对细胞悬液进行流式细胞术，以确定表面嵌合抗原受体表达。将新管设置为空白和 CAR。

单击 FSCA、FSCH、SSCA、SSCH、PE 和 FITC 通道。然后创建四个散点图以依次识别单个细胞、活细胞、GFP 阳性和 PE 阳性细胞。设置用于收集 10， 000 个单个活细胞的参数。

单击 acquire data。cell collection 稳定后，单击 record data。为了根据阴性对照确定门的位置，对 EGFP 和藻红蛋白阳性的细胞进行门控，以测量藻红蛋白阳性和中位荧光强度。

相对于常氧条件，每两个靶向 CAR 的缺氧敏感度显示 CAR 在缺氧条件下的表达显着高。