首先,获得在移植最佳条件下生长的白血病细胞。计数细胞后,在室温下以 300g 沉淀 5 分钟,然后弃去上清液。对于 CM-Dil 染色,将细胞重悬于工作溶液中,以获得 100 微升中 6 个细胞的 1 倍 10 次方,并在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。
在室温下用 10 毫升 1X HBSS 洗涤细胞两次。将细胞以 300g 沉淀 5 分钟后,将它们重悬于含有 1% FBS 的 PBS 中,以达到每微升 40, 000 个细胞的密度。然后打开微型注射器和泵。
将注射压力设置为每平方英寸 9 到 11 磅,在注射时间内设置为 0.5 秒,用于夹住针头并设置孔口。小心地将大约 5 微升的肿瘤细胞悬浮线一次性加载到微针中,避免气泡形成。使用 Dumont 5 镊子,切开针头的末端,产生一个可以支撑弹射的孔口。
然后在显微镜下选择健康的斑马鱼胚胎,排除任何有发育异常的胚胎。使用玻璃巴斯德移液管,拾取麻醉的胚胎,并将其中的10至15个在1.5%琼脂糖板上的横向位置排列。去除多余的水,留下胚胎存活的最低量。
接下来,在光学显微镜下确认针头切割良好并且有细胞。将相当于 400 至 600 个细胞的 10 至 15 纳升注射到胚胎的卵黄中 0.2 至 0.3 秒。注射所有胚胎后,将它们收集在新鲜的胚胎水中。
注射后一小时,监测细胞团,以将具有最佳染色或良好团块的胚胎与染色较差或团块较差的胚胎分开。CM-Dil 染色和荧光蛋白标记可以通过显微镜监测疾病进展。注射两种基因不同的白血病系后,胚胎的存活率下降。