为了用细菌噬菌体感染沙门氏菌培养物,将肠道沙门氏菌的过夜培养物稀释为最终体积为 5 毫升 LB,并向其中添加 0.1 毫升先前制备的细菌噬菌体裂解物。然后在 37 摄氏度和 200 RPM 下孵育 24 小时。在 50 毫升锥形离心管中,将含有噬菌体的细菌培养物稀释 100 倍,溶于 5 毫升 0.22 微米过滤的 LB 中。将悬浮液以 2, 377g 离心 10 分钟。
小心地倒出上清液,在底部留下一些体积以确保细胞的存在。用 10 毫升 0.22 微米过滤的 LB 培养基洗涤细菌细胞。重复离心和洗涤 3 次后,将沉淀重悬于 5 毫升过滤后的 LB 中。采用真空过滤系统,通过无菌 0.45 微米过滤器过滤 50 微升获得的细菌悬浮液。
用 100 毫升过滤后的过滤器冲洗过滤器 LB.To 以促进噬菌体从细菌细胞中释放,在不拆卸系统的情况下孵育含有细胞的过滤器。如前所述,使用真空过滤系统再次冲洗过滤器。要使用无菌镊子从过滤器中回收细菌细胞,请将过滤器转移到培养瓶中。
然后在过滤器上加入 2 毫升 2x LB 并移液数次以将细胞从过滤器中释放出来。将 1 毫升这种混悬液以 10, 354g 离心 2 分钟。弃去上清液后,用 1 毫升过滤的 LB 培养基洗涤细胞 3 次。
然后将细胞重悬于一毫升 2x LB 中。接下来,将商业沙门氏菌肠道脂多糖 (LPS) 与 20 微升细菌悬浮液混合在 1 毫升过滤的 LB 中。将混合物在 37 摄氏度下孵育 2 小时,并以 200 RPM 摇动,以防止细菌噬菌体再次感染。之后,将 1 毫升培养物转移到微量离心管中,并以 10, 354g 的浓度离心悬浮液 2 分钟。用 1 毫升过滤的 LB 培养基洗涤沉淀 3 次。
洗涤后,将沉淀重悬于 1 毫升 2x LB 中。将 20 微升这种混合物加入 1 毫升过滤后的 LB 中,每毫升含有 0.8 毫克的商业 LPS。并将混合物在 37 摄氏度和 200 RPM 下孵育两个小时。接下来,在微量离心管中以 10, 354g 离心 2 分钟,使 1 毫升培养物沉淀。
用过滤的 LB 洗涤细胞 3 次后,将它们重悬于 1 毫升过滤的 LB 中。使用真空过滤系统,将 1 毫升细菌悬浮液通过无菌 0.45 微米过滤器,然后使用 100 毫升过滤后的 LB 冲洗过滤器。使用无菌镊子将过滤器转移到培养瓶中。在过滤器上加入 2 毫升 2x LB 并移液数次以将细胞从过滤器中释放出来。将 1 毫升细胞以 10, 354 g 离心 2 分钟,然后用过滤的 LB 洗涤 3 次。将收集的细胞重悬于一毫升 2x 中 LB.To 制备无噬菌体接种物,将 100 微升细胞从细菌悬浮液中加入到 900 微升含有 0.45 毫克/毫升 LPS 的 LB 中。
在 37 摄氏度下孵育 24 小时,并以 200 RPM 振荡。将其用作等分试样以确认不存在噬菌体再感染。通过在方案的不同阶段进行滴定,观察到重复洗涤和过滤不足以从培养物中去除噬菌体。
然而,一旦采用与商业 LPS 一起孵育的步骤,噬菌体的数量就会减少。完全去除细菌培养物中噬菌体的关键步骤是与商业 LPS 的第二次孵育。