人脐静脉内皮细胞 （HUVEC） 的球状体发芽测定，用于研究体外血管生成

首先，将 HUVEC 添加到含有 8 毫升内皮生长培养基的 10 毫升 Falcon 管中。将 2 毫升美多秀原液加入试管中并摇匀。接下来，将 25 微升混合物转移到一个大的方形培养皿的倒置内表面。

轻轻将盖子旋转 180 度，将其放在细胞培养容器的底部并孵育过夜。第二天，将 2.3 mL 大鼠尾部胶原蛋白 I 型加入到含有 0.28 mL 10X 199 培养基的小瓶中。将此混合物放在冰上，搅拌至均匀呈黄色。

用氢氧化钠滴定混合物，直到它变成橙色。然后，向最终产品中加入 50 微升 HEPES 缓冲液。将悬挂的培养细胞收集到含有 20 ml PBS 的 50 ml Falcon 管中，然后离心。

弃去上清液后，向球状体沉淀中加入 0.1 ml FBS 和 0.4 ml 内皮基础培养基。轻轻敲击试管以重悬沉淀。现在，吸取 2 毫升美多秀原液并充分混合。

然后，将 2 毫升制备好的胶原蛋白混合物添加到重悬的球状体中。将 0.5 mL 所得混合物分配到 24 孔板的孔中并孵育。接下来，将 100 微升稀释的重组人血管内皮生长因子移液到板孔中。

将细胞培养物在 37 摄氏度下，在 5% 二氧化碳补充下孵育 12 小时。第二天，使用倒置显微镜捕获与孔边缘不接触或未显示损坏迹象的球状体的图像。仅用基础培养基或重组人血管内皮生长因子刺激的球状体可明显区分。

低质量凝胶中的球状体似乎掉落到地面并分散。阴性对照显示中等基线发芽速率，而人血管内皮生长因子的相对发芽长度增加了一倍或三倍。芽的数量显示出相似的动态范围。