首先，通过在 Hank 平衡盐溶液中补充 10 毫摩尔堆缓冲液来制备洗涤缓冲液。将缓冲液储存在 4 摄氏度直至使用。在 DMEM 中制备视网膜色素上皮或 RPE 培养基，并在水浴中预热至 37 摄氏度。
将安乐死的老鼠平放，眼睛朝上。将食指放在眼睛上方，将拇指放在眼睛下方。轻轻按压眼睛周围的骨骼结构，使眼球突出。
将略微张开的剪刀的尖端插入眼睛下方，轻轻地将手腕从眼睛向外旋转 90 度，直到眼睛从眼窝上分离。立即将眼睛放入 70% 乙醇中并翻白眼 5 秒钟。然后将眼睛转移到保存在冰上的洗涤缓冲液中。
在解剖显微镜下，将眼睛放入装满洗涤缓冲液和浸泡纱布条的培养皿中。用镊子握住视神经并使用手术刀轻轻地在 Ora Serrata 水平切开，以稳定眼睛。将 Vannas 剪刀插入切口，并在 Ora Serrata 的圆周周围剪断，直到去除前段和玻璃体。
使用系留镊子轻轻地从眼罩上剥离视网膜，而不会干扰 RPE 层。在剪刀的帮助下，从眼罩上去除视神经和多余的结缔组织，而无需刺穿眼罩。将眼罩转移到含有 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 的 1.5 毫升微量离心管中。
将眼罩在 37 摄氏度的水浴中孵育 10 分钟。每两分钟取出试管，将底部用力敲击台面 40 次。孵育后，使用 AP-1000 移液器轻轻上下混合 3 次以破坏眼罩。
为了中和胰蛋白酶，立即将分离的 RPE 片（不包括眼罩）分层到 15 毫升锥形管中的 0.5 毫升 FBS 上。然后逐滴将 RPE 培养基添加到 FBS 和 RPE 片材层上以稀释胰蛋白酶。将 RPE 以 340G 离心 3 分钟。
弃去上清液，将细胞重悬于适量的 RPE 培养基中，用于 24 孔板。将 RPE 在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育三天。RPE 分离后 24 小时，有核色素细胞开始沉降，没有完全粘附。
在 48 到 72 小时内，这些细胞附着并扩散，将深色色素沉着保留在透明细胞核中。五天后，RPE 细胞在开始形成细胞间接触时表现出更高的共流畅性，形成具有六边形结构的极化单层。分离的 RPE 在培养 6 天后显示出纯度，RPE 特异性标志物和紧密连接完整性证明了这一点。
