使用荧光显微镜在原代小鼠 T 细胞的亚细胞水平上检测 Ca²⁺ 微结构域

首先，将 10 微升加载的 CD4 + 细胞放在准备好的玻片上，让它们附着 3 到 5 分钟。向载玻片中轻轻加入 80 μL 钙测量缓冲液。选择 100X 油浸镜头。

滴一小滴浸油，将载玻片放在显微镜载物台上。然后在明场模式下调整焦距。选择最多包含 10 个彼此不接触的单元格的视野并获取图像。

接下来，在 1 分钟后加入 10 微升抗体包被的微珠或兴奋剂，并使用每秒 40 帧或可能的最大帧速率测量总共 3 分钟。使用滑块确定微珠与目标细胞之间的接触时间。在右侧的 Options 菜单中，选择 Bead contact：x， y， t。

选择图像左侧细胞和磁珠接触的位置。选择 选择单元格 通过单击内部的点。单击受此珠子刺激的细胞，最好在中心。

单击 ADD bead contact（添加磁珠触点）。定义所有微珠接触后，单击“继续”按钮并继续处理其他文件野生型细胞在刺激后的第一秒内显示出快速的钙微结构域形成，并在随后的 15 秒内扩展到整个细胞。相反，P2x4 和 P2x7 突变细胞显示钙微结构域形成减少，P2x4 突变细胞在刺激前也表现出较低的基础水平。

与小鼠 T 细胞一样，在人 CD4+T 细胞的微珠接触位点观察到钙微结构域。