首先，将胰蛋白酶消化的 Sf1Ep 细胞培养物和 6 孔板放在工作平台上。向 6 孔板的每个孔中加入适当数量的 Sf1Ep 细胞和 Sf1Ep 培养基。将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。
将 TpCM-2 的组分混合在无菌容器中，最后加入二硫苏糖醇作为干粉。轻轻混合并使用 0.22 微米过滤装置对培养基进行消毒。在厌氧罐中预平衡培养基，使用室内真空抽空腔室，并用 95% 氮气和 5% 二氧化碳混合物重新填充 3 次。
然后重新填充 1.5% 氧气、5% 二氧化碳并平衡氮气混合物。将培养基快速转移到 34 摄氏度的三气培养箱中，并孵育过夜。孵育过夜后，从 Sf1Ep 培养物中取出培养基，并用少量预平衡的 TpCM-2 冲洗细胞。
去除冲洗液后，加入适量的 TpCM-2，在 1.5% 氧气、5% 二氧化碳中平衡板，并在 34 摄氏度的氮气气氛中平衡 3 至 4 小时。从低氧培养箱中取出现有的梅毒螺旋体培养物，并检查每个孔中的 Sf1Ep 细胞层。记录细胞密度和外观后，将培养基从每个孔中移液到无菌的 15 ml 锥形管中。
用 0.35 mL 预热的胰蛋白酶-EDTA 冲洗每个孔，并将冲洗液加入 15 mL 试管中。向每个孔中再加入 0.35 毫升胰蛋白酶-EDTA，并在 37 摄氏度下孵育 5 分钟，以从板中去除 Sf1Ep 细胞，从 Sf1Ep 细胞中去除梅毒螺旋体。分离后，将解离的梅毒螺旋体和 Sf1Ep 细胞与 15 毫升锥形管中收集的储备培养基混合，并记录检索到的总体积以计算每次培养的产量。
用一定体积的收获的梅毒螺旋体接种先前制备的 Sf1Ep 细胞板。交换板中的气氛后，在 34 摄氏度下在啤酒瓶或三气培养箱中孵育。接种后，使用辅助计数室在暗视野显微镜下计数梅毒螺旋体。
向梅毒螺旋体培养物中加入 50% 甘油至终浓度为 10%，并通过轻轻移液或倒置分散甘油。将制备物以 1 至 2 mL 的等分试样分配到带螺口的冻存瓶中，并立即将冻存管放入 80 摄氏度的冰箱或液氮冰箱中。准备并预平衡两个 96 孔板，每孔含 1000 个 Sf1Ep 细胞和 200 微升 TpCM-2，并在组织培养箱中孵育过夜。
第二天，如前所述，用 TpCM-2 替换 Sf1Ep 培养基。定量后，在 TpCM-2 中稀释梅毒螺旋体，产生浓度分别为 10 和 40 个细胞/毫升的两种制剂。将每孔 50 微升的 10 mL梅毒螺旋体制剂接种到制备的 96 ell 板之一中。
在每个板的两个对照孔中，将 2 x 10 接种至每毫升稀释 3 次梅毒螺旋体的幂。用低氧气体混合物平衡板，并在 34 摄氏度的啤酒瓶或三气培养箱中孵育。第 7 天，去除一半的培养基，并用新鲜的平衡 TpCM-2 替换。
一旦通过暗场显微镜鉴定出阳性孔，将阳性孔胰蛋白酶消化，并将细胞悬液转移到先前制备的 24 孔板中以进一步扩增。梅毒螺旋体通常保留超过 90% 的运动性，并以 33 至 45 小时的倍增时间进行对数繁殖，持续约 7 天，然后进入固定期。在一周的过程中，螺旋体经历了大约 4 到 5 次倍增。
