一旦原代小鼠气道上皮细胞达到 80% 汇合，将细胞放在涂有大鼠尾部胶原蛋白的载玻片上。然后，添加多聚甲醛以固定细胞 12 小时。用 PBS 洗涤玻片 3 次，每次 5 分钟，然后与 3% 牛血清白蛋白和 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液孵育 1 小时。
将稀释度为 1 比 500 的抗泛细胞角蛋白抗体添加到载玻片上，并在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，用 PBS 溶液洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟，然后与稀释度为 1 至 1， 000 的二抗在黑暗中孵育 2 小时。用 PBS 洗涤玻片后，加入稀释度为 1 至 1， 000 的 DAPI，并孵育 15 分钟。
用 PBS 洗涤玻片一次，每次 5 分钟。在荧光显微镜下观察载玻片，将表达模式与阳性对照和阴性对照进行比较分离和离心后，将 P2 期细胞重悬于适当体积的扩增培养基中。将 1 毫升细胞悬液移液到 Transwell 聚碳酸酯膜插入物的顶腔上。
将 1.5 毫升增殖培养基添加到 Transwell 的基底隔室中。在 37 摄氏度下孵育细胞，直到达到汇合。使用以下组分制备 50 mL 完全分化培养基。
将一支香烟通过 12.5 毫升分化培养基起泡，然后通过 0.22 微米倒滤器过滤，制备香烟烟雾提取物或 CSE。为确保 CSE 实验和批次之间的标准化，请在分光光度计上测量 320 纳米处的吸光度。接下来，从 Transwells 的顶端和基底腔中取出扩增培养基。
添加含有适当浓度 CSE 的分化培养基，以刺激原代小鼠气道上皮细胞 28 天。在孵育期间，每周用 PBS 洗涤顶腔两次，并用新鲜制备的含有 CSE 的分化培养基替换基底腔中的培养基。小鼠气道上皮细胞在 28 天内在气液界面成功分化。
分别通过纤毛标志物、乙酰化 α 微管蛋白和杯状细胞标志物粘蛋白 5AC 的免疫荧光测定证明纤毛细胞和杯状细胞的存在。不同 CSE 浓度下 24 小时的细胞活力表明，当浓度高于 6% 时，上皮细胞活性下降，长期刺激下的细胞活性在 2%4% 和 6%CSE 浓度下没有明显的细胞死亡。但注意到跨膜抗性和脱落细胞的变化。
此外，当小鼠气道上皮细胞培养物长期暴露于 CSE 时，分化细胞和纤毛细胞总体减少。
