在梯度注射器中计数细胞，用于研究空间分辨条件下的嗜甲烷菌生长

首先，从梯度注射器中获得挤出的琼脂糖片段，接种有野生型或突变型 methylomona 物种 LW13。向挤出的琼脂糖样品中加入 0.75 毫升 0.85% 氯化钠的水溶液，涡旋匀浆。此外，在新的 微量离心管中用 900 μL 盐溶液稀释样品 1 至 10。

将样品与 3 μL SYTO 9 和碘化丙啶染料的一对一混合物在室温下避光孵育 15 分钟。要测定每毫升琼脂糖的细胞数，请在水浴中对微球计数微珠悬浮液超声处理 5 分钟。然后在流式细胞术分析之前向样品中加入 10 微升悬浮液。

使用流式细胞仪分析样品。比较无细胞对照样品和接种琼脂糖样品之间的侧向散射和前向散射操作图，以绘制排除背景琼脂糖颗粒的细菌事件电压门。要对梯度注射器内的集落形成单位进行计数，将 800 μL 硝酸盐矿物盐培养基添加到挤出的琼脂糖段中，涡旋 10 秒以帮助移液。

准备一个无菌 96 孔板，每个孔中含有 180 μL 硝酸盐矿物盐培养基。向第一柱的每个孔中加入 20 μL 稀释的琼脂糖样品并混合。使用多通道移液器，从第一排孔开始，将 20 μL 样品连续稀释 10 倍。

标记含有硝酸盐、矿物盐、螺旋钻或所选培养基的方形网格板。使用多通道移液器，从 96 孔板的一列中点样 5 微升到螺旋板上。使用挤出琼脂糖样品的流式细胞术证实，与野生型菌株相比，LW13 的 OAT 缺失突变体显示细胞生长减少。

突变体与 OAT 基因的互补使细胞数量和条带形成恢复到与野生型相似的水平，表明该基因在条带形成中的特定作用。