首先,进行聚合酶链反应或 PCR,以扩增组织提取的 DNA 的所需区域。将测序扩增酶预混液、缓冲液和双蒸水加热至室温并立即离心。准备好用于测序的试管后,将 PCR 试管放在预设的 PCR 仪器上进行扩增。
然后从 PCR 仪器中取出产物,并将反应产物避光存放在冰箱中。彻底涡旋磁珠。向 96 孔板中加入 10 微升磁珠和 40 微升 80% 乙醇,并用薄膜密封板。
将 96 孔板放在涡旋摇床上 10 秒钟,以完全悬浮和混合微珠。然后用橡皮筋将板固定在水平振荡器上,并以最大设置振动 3 到 5 分钟。接下来,将 PCR 板放在磁力架上,确保其被用力按压。
将支架保持在 4 摄氏度 3 分钟以进行静电吸附。吸附珠子后,撕下天花板薄膜并倒出废液。用 40 μL 80% 乙醇冲洗珠子两次。
倒掉废液后,将板放在吸水纸上,轻轻拍干。将带有磁板的吸收纸放入离心机中,并以 120 g 的离心速度短暂旋转。去除酒精后,将板放入 60 摄氏度的烤箱中 3 到 5 分钟,以完全干燥珠子。
接下来,向板中加入 40 微升纯水并用薄膜密封。在涡旋摇床上摇晃 3 到 5 秒钟,然后将板放在水平摇床上。固定板,让板摇动 3 到 5 分钟,以溶解纯化的测序产物。
最后,将溶解的测序产物以 180 g 离心,并使用该产品进行毛细管电泳的基因组分析。该方法可检测已知的 RHOA G17V 突变以及上下游引物扩增区间中的其他低频突变。使用这种方法也正确分析了另外两个基因,即 IDH2 和 JAK1 的突变。