首先，将新鲜制备的过滤灭菌封闭缓冲液、10X 反应缓冲液 1 和 2 放在工作平台上。将含有 2.5 毫升封闭缓冲液和 5 毫升超纯水的开放试管放入干燥器中，并在真空下脱气。15 分钟后，释放压力并取出管子。
将准备好的生物素-PEG 流通池组件放在显微镜载物台上，并在两端用胶粘剂腻子固定。通过针头将流通池出口管路连接到注射泵。将物镜加热器打开至 30 摄氏度。
将试管中的 1 到 2 毫升脱气水固定在流通池附近的单独粘性腻子上。将入口管插入管中，直到它到达底部并流过通道。增加流速以去除入口管路附近任何滞留的气泡。
将 100 μL 脱气封闭缓冲液添加到 20 μL 等分试样（每毫升 1 毫克）链霉亲和素中。将打开的管子连接到粘性腻子上。将入口管从水中转移到链霉亲和素中，并以每分钟 40 μL 的速率开始流速，持续 2 分钟。
5 分钟后，用封闭缓冲液洗去过量的链霉亲和素。流入在含有 25 纳摩尔 SYTOX Orange 的封闭缓冲液中稀释的生物素化 DNA。使用 532 纳米激光器的实时取景进行成像，实时观察 DNA 拴系到表面。
一旦表面的 DNA 达到所需的密度，流入含有 25 纳摩尔 SYTOX 的封闭缓冲液以洗出游离 DNA。现在，在含有 25 纳摩尔 SYTOX Orange 的封闭缓冲液中稀释的流式和生物素化抗地高辛抗体。用封闭缓冲液洗出生物素化的抗地高辛抗体和 SYTOX Orange。
将 50 μL ATP-γ-S 混合物流入流通池。在 30 微升 ATP-γ-S 混合物中加入纯化的 CMG 解旋酶至约 100 纳摩尔的最终浓度，并以 20 微升/分钟的速度流动 20 微升。孵育 15 分钟。
接下来，以每分钟 40 微升的速度流入 ATP RPA 混合物，流入 80 微升。使用每个曝光时间为 50 到 100 毫秒的激光器，用 488 纳米激光器可视化和采集 EGFP RPA，然后用 640 纳米激光采集 CMG。最后，使用 532 纳米激光观察并获取 SYTOX Orange 染色的 DNA。
通过随时间跟踪的黄色 RPA 的线性生长来观察 DNA 的 CMG 解旋酶解旋，表明解开的 DNA 链。单链 DNA 损伤减少了观察到的成功解旋事件的数量，数据中较少的完整痕迹证明了这一点。
