松树线虫体外松树枝条培养物的建立和感染

首先，在流动的自来水中清洗经过认证的 Pinus pinaster 种子，以去除较大的碎屑。然后使用普通洗涤剂溶液在剧烈搅拌下清洗较细的碎屑。在流动通风橱中，加入市售漂白剂溶液，直到种子被覆盖，然后剧烈混合 15 分钟。

丢弃漂白剂溶液后，用消毒的自来水冲洗种子 3 次。现在将种子浸入 80% 乙醇中 15 分钟，并剧烈搅拌。处理掉乙醇后，用消毒的超纯水洗涤种子 3 次。

对于松树发芽，用无菌机械车床打破消毒的种皮。分离松子，将它们放在带有消毒湿滤纸的密闭容器中，使其水合过夜。第二天，将脱水松子在 4 摄氏度下分层 7 天，以打破休眠并同步发芽。

然后将松子在 25 摄氏度的黑暗中保持直到发芽。将无菌发芽的松树转移到受控的环境条件下两周，或直到主茎开始发育。两周后，用手术刀切下根部上方幼苗的地上部分，并将其转移到灭菌的 Schenk Hildebrandt 培养基中。

如前所述，将培养物维持在受控的环境条件下。通过用无菌手术刀切割芽基部的胼胝组织定期进行传代培养。使用无菌镊子将芽簇转移到新鲜的增殖培养基中。

接下来，将微芽接种到每升活性炭中含有 3 克活性炭的 Schenk Hildebrandt 培养基中，以实现微茎伸长。现在将细长的嫩芽放入不含植物激素或活性炭的 Schenk Hildebrandt 培养基中。在微芽底部添加 100 至 150 个混合生命阶段灭菌的松木线虫。

如前所述，将培养物维持在受控的环境条件下。体外松芽的建立和感染表明，在与松木线虫共培养后一个月内出现绿针。