首先，将健康和退化的果蝇眼睛图像放在同一个文件夹中。确保文件命名正确，以识别实验组并区分男性和女性。打开 Ilastik 软件。
点击 Create New Project。然后从 Other Workflows（其他工作流程）中选择 Cell Density Counting（细胞密度计数）并选择保存项目文件的位置。依次单击 1。
Input Data、Add New 和 Add Separate Images 以选择标准图像。然后点击 2。Feature Selection 并选择特征。
选择更多的 sigma 值以提高灵敏度。点击 3.计数并将前景 sigma 值设置为 5.00。
使用前景工具，在标准图像上标记 50 个或更多单独的 ommatidia。点击 3.再次计数并使用背景工具标记 ommatidia 之外的区域。
在 ommatidia 周围画出格子形状的绿线。点击 4。Density Export 并选择 Export Image Settings （导出图像设置） 以调整图像设置。
然后单击 输出文件信息 并选择 格式 tiff 以便在 Flynotyper 中进一步分析。点击 5。批处理，选择原始数据文件，然后选择所有要分析的实验性苍蝇照片。
要分析的导入图像列表位于 Select Raw Data Files 下。点击 处理所有文件 在 5 的底部。Batch Processing 部分。
软件完成处理后，检查包含实验蝇眼图像的文件夹。确认存在命名的黑色图像，即您的样本名称概率。在 ImageJ 中，打开 Ilastik 生成的 tiff 文件。
使用矩形选择工具在眼睛周围创建一个矩形。选择 Ctrl X 或 Control C 以裁剪区域，并等待矩形轮廓形状的黑框出现。依次单击 文件， 新建及 内部剪贴板 打开裁剪的飞眼。
要将剪下的飞眼保存为 JPEG，请单击 文件， 另存为 和 JPEG。在 ImageJ 中，单击插件和 Flynotyper。在 Genotypes 下，选择 Add Genotypes 并打开包含切蝇眼图像的文件夹。
勾选 Light Microscope 和 Vertically 框。然后在 Ommatidia 排名依据，选中 稳定性 和 到中心的距离 框。对于考虑的排名 ommatidia 的数量，将 input 设置为 200。
单击 Run 并等待分析结果出现。将样品文件和 P 分数复制并粘贴到统计软件中，以便进一步分析。与没有环形光的图像相比，用 Ilastik 处理并在环形光下分析的果蝇眼睛图像显示出更清晰的乳房图案，增强了定性评估。
Flynotyper 分析表明，与非退化的眼睛相比，中度和重度退化的苍蝇眼的表型评分显着更高。当不使用 Ilastik 时，未退化和中度退化的眼睛之间的 P 分数相似。
