为了分离线粒体，将麻醉的斩首大鼠置于冰上的俯卧姿势。暴露心脏后，在主动脉根部上方和颈动脉分支点下方约 4 到 6 毫米处切开主动脉。对主动脉进行插管，并使用重力依赖性压力头用冰冷的心脏停痹溶液灌注心脏，直到冠状动脉清除血液并且器官看起来发白。
解剖心房、软骨瓣膜组织和脂肪组织，以分离心室心肌。用锋利的手术剪刀将组织切碎，直到碎片大约为 1 立方毫米。将切碎的组织转移到预冷的离心管中，标记含有蛋白酶溶液的离心管 1 和 2。
加入冰冷的分离缓冲液至最终体积为 25 mL。使用电动手持式转子定子匀浆器，将组织以 18， 000 RPM 的速度分散在冰上 20 至 25 秒。将匀浆组织在 8， 000 G 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟。
丢弃上清液。并用 5 毫升分离缓冲液轻轻冲洗沉淀，以去除残留的蛋白酶。丢弃冲洗液后，加入冰冷的分离缓冲液，使最终体积为 25 mL。
然后涡旋以重悬沉淀。将组织匀浆在 4 摄氏度下以 800 G 离心 10 分钟。将含有线粒体的上清液轻轻倒入标记的预冷 50 毫升试管中。
现在将上清液在 8， 000 G 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟。弃去上清液并保留含有线粒体的沉淀。使用无绒擦拭布，从试管内壁吸收多余的上清液，而不会干扰沉淀，然后将试管放在冰上。
在管底部加入 80 微升冰冷的隔离缓冲液，并使用微量移液器轻轻重悬线粒体。重悬后，将线粒体转移到预冷的标记微量离心管中。使用 bison kinetic acid protein 测定法测定线粒体蛋白浓度。
在预冷的微量离心管中，用分离缓冲液将线粒体原液稀释至所需的工作浓度。为了测试线粒体分离株的活力和质量，将 2.3 毫升呼吸缓冲液加载到 Oxygraph 室中。让耗氧量信号在 37 摄氏度下平衡约 10 分钟或直到耗氧量接近零。
平衡后，向下推塞子并吸出多余的缓冲液。使用 10 微升 Hamilton 注射器，添加 1 毫摩尔 EGTA 以螯合 Oxygraph 上呼吸缓冲液中的任何残留钙。为了促进呼吸，向缓冲液中加入 5 毫摩尔丙酮酸钠和 1 毫摩尔苹果酸醛。
然后加入一团稀释的线粒体，让呼吸发生 5 分钟。在 5 分钟标记处，快速推注 500 微摩尔 ADP 以启动第三状态呼吸。要计算呼吸控制比率，请将状态 3 期间的最大耗氧率除以状态 2 中加入 ADP 之前的耗氧率。
添加 ADP 后立即观察到耗氧量快速增加，表明在离体心脏线粒体中成功启动氧化磷酸化。来自豚鼠、Sprague-Dawley 大鼠和 Friend 白血病病毒 B 小鼠的心脏线粒体表现出高呼吸控制率，表明线粒体分离质量良好。来自 Sprague-Dawley 大鼠的肝脏和肾脏线粒体也表现出可接受的呼吸控制比率，支持成功分离。
HEK293 细胞表现出高于可接受阈值的呼吸控制比值，证实了从这些细胞中分离线粒体的质量。
