这项工作是部分支持由美国国立卫生研究院（GM093282到十五分; 3U54AI057158 - 06S1到RDS）和艾伯特爱因斯坦医学院的启动资金。

1。蛋的收集和Dechorionation <ol><li>收集和斑马鱼的卵转移到35mm培养皿中，删除尽可能多的水，然后添加1毫克/毫升Pronease在E3胚胎培养基E（5 mM氯化钠，0.17 mM的氯化钾，0.33毫米氯化钙2 · 2H 2 O，0.33毫米硫酸镁4，PH = 7.4），绒毛膜消化。 </li><li> 3-5分钟后，合并到一个烧杯中弥漫着鱼水（60毫克的“即时海洋”每公升蒸馏水H 2 O）的菜，轻轻的鸡蛋转移到烧杯中，并允许鸡蛋到入水“落“。 </li><li>鱼水三次冲洗的鸡蛋。从他们的绒毛膜大部分的鸡蛋会被释放。 </li><li>使用火抛光的玻璃巴斯德吸管，转让dechorionated鸡蛋琼脂糖涂层的培养皿菜肴充满E3胚胎中期。 </li></ol> 2。显微注射与国内生产总值FucAl <ol><li>以下报道的协议 7，准备注射菜。 </li><li>转移到充满E3胚胎中期注射菜dechorionated鸡蛋。 </li><li>准备针，2μL注射液和负载。该解决方案包含了20毫米的国内生产总值FucAl合成chemoenzymatically 8任的Alexa Fluor 594 -葡聚糖（5％W / V）作为示踪或酚红样染料（0.1％W / V）在0.2 mol氯化钾。作为阴性对照，与GDP -岩藻糖注射液取代国内生产总值FucAl。 </li><li>打破了针，调整喷油压力和持续时间，产生了1 NL下降9。 </li><li>注入1 NL的任何一个解决方案的鸡蛋。 </li><li>转移到琼脂糖涂层培养皿充满E3胚胎中期的菜蛋。 </li><li>在28 ° C孵育的鸡蛋和未受精的卵受精后三到四个小时内删除。 </li></ol> 3。 BTTES - 铜（I）催化点击化学反应<ol><li>当胚胎达到理想的发育阶段（如已故的原肠胚，组织分割和早期幼虫），外套一个96孔板，用琼脂糖基地。 </li><li> ，每孔加入92μLE3胚胎中期，随后另外4μL的Alexa Fluor 488叠氮（从一个2.5毫米的股票，在H 2 O），2μLBTTES，硫酸铜4 6:1复杂，和轻轻摇动混合。 </li><li>点击化学试剂使用火抛光的玻璃巴斯德吸管转移到胚胎。每口井应包含少于五个胚胎。 </li><li>添加2.5μL新鲜配制的抗坏血酸钠（100毫米股票在H 2 O）发起的点击反应 3 。终浓度为每一个试剂的Alexa Fluor 488叠氮：100微米; 硫酸铜 4：50微米; BTTES：300微米;抗坏血酸钠：2.5毫米。 </li><li> 3分钟后，加入2微升bathocuproine磺酸（H 2 O 50毫米股票），生物相容性铜螯合剂，然后立即稀释100μLE3胚胎中期淬火反应。 </li><li>胚胎玻璃培养皿和清洗处理的胚胎与15毫升的E3胚胎中期的2倍。 </li></ol> 4。成像<ol><li> MatTek玻璃底部的微孔盘上放置一个超低熔点琼脂糖（E3胚胎中期的1.2％（W ​​/ V））的下降，胚胎放入琼脂糖下降。 </li><li>位置的胚胎背侧或外侧，并置于冰上5分钟，以巩固琼脂糖下降的菜。 E3胚胎培养基添加轻轻的菜，直到它涵盖了琼脂糖下降。 </li><li>顺序使用共聚焦显微镜，荧光和明亮的现场图像采集。所有胚胎图像采集使用一个5微米的一步区间。综合数字准备使用ImageJ软件。 </li></ol> 5。代表性的成果图1显示了我们两个步骤的标签战略的工作流程。图2显示了斑马鱼的胚胎在受精后9.5小时（HPF）通过BTTES介导CuAAC标签。 BTTES是一个三（triazolylmethyl）胺为基础的配体。它加速CuAAC显着时在原位生成铜（一）协调，促进在生物系统中的环加成反应迅速没有明显的毒性。紧接着一个3分钟的点击反应，我们能够探测到强大的国内生产总值FucAl处理的胚胎标签（图2，左侧面板）。只有背景荧光检测控制胚胎显微注射与GDP -岩藻糖（图2中，右图）。 <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig1.jpg" alt="图1" /> 图1标签fucosylated聚糖在斑马鱼胚胎的包围层的战略。 <img src="/files/ftp_upload/2686/2686fig2.jpg" alt="图2" /> 图2。fucosylated聚糖通过BTTES铜（I）催化点击化学斑马鱼胚胎发育期间体内成像。单细胞阶段斑马鱼的胚胎显微注射单剂量的国内生产总值FucAl并允许发育运到9.5 HPF。胚胎的Alexa Fluor 488叠氮BTTES铜（一）催化反应。使用共聚焦显微镜成像反应胚胎。最大强度Z -投影图像的Alexa Fluor 488荧光（上图）;明场（下图）。比例尺：100微米。 故障排除<table border="1"><tbody><tr><td>问题</td><td>原因</td><td>补救</td></tr><tr><td>看不健康的胚胎</td><td>显微注射的溶液中含有污染物</td><td>核苷酸糖的纯度应大于85％。检查你的源代码。 </td></tr><tr><td>没有标签后的反应</td><td>铜浓度低于30微米</td><td>要小心，不要稀释反应液加​​入过量E3胚胎培养基加入胚胎时，反应率显着下降，当铜浓度低于30微米的。 </td></tr><tr><td>胚胎死亡后的反应</td><td>胚胎处理不当</td><td>确保吸管火抛光和反应容器涂一层非常薄的0.5％琼脂糖。 </td></tr><tr><td>图像看起来参差不齐</td><td>所用试剂不正确混合后再加入胚胎</td><td>按照建议的顺序添加试剂，并确保点击化学试剂已正确之前加入胚胎混合。 </td></tr><tr><td>图像显示，胚胎受损</td><td>剧烈摇晃的​​胚胎损害的反应过程中</td><td>一旦胚胎是在溶液中轻轻摇动少于10秒。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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	<li>Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+glycome.">Imaging the glycome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12-17 (2009).</li><li>Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+click+chemistry:+Covalent+labeling+in+living+systems.">Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems.</a> Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).</li><li>Soriano del Amo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+copper(I)+catalysts+for+in+vivo+imaging+of+glycans.">Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).</li><li>Chang, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars.">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).</li><li>Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+membrane-associated+glycans+in+developing+zebrafish.">In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish.</a> Science. 320, 664-667 (2008).</li><li>Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+enveloping+layer+glycans+during+zebrafish+early+embryogenesis.">Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).</li><li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation.">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoenzymatic+synthesis+of+GDP-L-fucose+and+the+Lewis+X+glycan+derivatives.">Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+organization+of+the+zebrafish+fate+map.">Origin and organization of the zebrafish fate map.</a> Development. 108, 581-594 (1990).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt;成像生物分子<em&gt;在体内</em提供在其原生环境的生物活动的重要见解。在这段视频中，我们将演示如何BTTES介导的生物相容性CuAAC通过显微注射与国内生产总值的FucAl一细胞阶段的胚胎和一个第二步荧光基团的共轭实现fucosylated聚糖在斑马鱼胚胎的包围层的标签<sup&gt; 3</sup&gt;。强大的标签可在2-3分钟内取得，并标记聚糖2.5 HPF早期检测。重要的是，国内生产总值的FucAl单剂量可以产生可检测的荧?...

<table border="1"><tbody><tr><td>试剂名称</td><td>公司</td><td>目录编号</td></tr><tr><td>铜（II）硫酸硫酸钠</td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> 203165 </td></tr><tr><td>的Alexa Fluor 488叠氮</td><td> Invitrogen公司</td><td> A10266 </td></tr><tr><td>右旋糖酐的Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen公司</td><td> D - 22913 </td></tr><tr><td> （+） - L -抗坏血酸钠</td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> A7631 </td></tr><tr><td> Bathocuproinedisulfonic酸</td><td> Acros Organics公司</td><td> 164060010 </td></tr><tr><td>玻璃底部的微孔盘</td><td> MatTek </td><td> P35G - 1.5 - 14 - C </td></tr></tbody></table>

imaging glycans in zebrafish embryos by metabolic labeling and bioorthogonal click chemistry

活体成像聚糖最近已经启用了一个bioorthogonal化学记者战略治疗叠氮或炔标记的单糖1，2细胞或生物体。修改后的单糖，聚糖的生物合成机制处理，纳入细胞表面的糖复合物。 bioorthogonal叠氮或炔标签用于可视化的荧光探针，然后让共价键共轭，或用浓缩和glycoproteomic分析的亲和力探头。这个协议描述fucosylated聚糖在斑马鱼胚胎的无创成像通常使用的，包括程序：1）单细胞阶段的胚胎显微注射与国内生产总值5 alkynylfucose（国内生产总值FucAl），2）标签包围层fucosylated聚糖通过生物 ​​相容性铜（I）催化叠氮炔环加成反应（CuAAC），并通过共聚焦显微镜3 3）成像叠氮共轭荧光团的斑马鱼胚胎。这里描述的方法可以很容易地扩展到其他类别的聚糖，如含有唾液酸4 和 N -乙酰5，6的糖链，在发展中国家斑马鱼和其他生物可视化。

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Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

点击化学的方法，允许炔标签聚糖在斑马鱼胚胎的快速，非侵入性和强大的标签描述。在这项研究中，已故的原肠胚形成阶段，在斑马鱼胚胎的包围层Fucosylated聚糖成像。

在斑马鱼胚胎的代谢标记和Bioorthogonal点击化学成像聚糖

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

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13.5K 次观看.  Albert Einstein College of Medicine, Yeshiva University. 点击化学的方法，允许炔标签聚糖在斑马鱼胚胎的快速，非侵入性和强大的标签描述。在这项研究中，已故的原肠胚形成阶段，在斑马鱼胚胎的包围层Fucosylated聚糖成像。