这项工作得到了一个丹·邓肯的合作研究资助（CMB和EJS），美国国家心脏，肺，和血液研究所（US4HL081007），白血病和淋巴瘤协会临床研究学者奖（CMB），美国国家癌症研究所（RO1 CA06150816 EJS）。

1。单核细胞分离（0天） <ol><li>插入秒杀到出口的20％部分的脐带血阴鲁尔适配器，连接注射器和清除血液中。解冻血液转移到20毫升温热在50ml离心管中的RPMI。用5毫升的RPMI冲洗脐血袋和转移到相同的离心管中。 </li><li>离心细胞以400×g进行10分钟。吸出上清液。 </li><li>在20毫升的温暖的RPMI重悬细胞。到在50ml离心管中的15毫升淋巴制剂层细胞。离心40分钟@ 400×克。 </li><li>含有单核细胞的收获的接口，并在20毫升的RPMI清洗。离心10分钟@ 450×克。 </li><li>吸液上清液，并在20毫升的RPMI清洗。计数细胞和旋转5分钟@ 400×克。 </li><li>吸液上清液和重悬细胞，在5×10 6个细胞/ mL的Cellgenix：直流介质（无血清）。为EBV-LCL代的取出1毫升，放入15毫升CEntrifuge管。 </li></ol> 2。树突状细胞生成（第0天） <ol><li>板2毫升的细胞（已经在5×10 6细胞/ mL的直流媒体）成一个6孔板每孔。发表在1-2个小时的孵化器。 </li><li> 1-2小时后，洗掉非贴壁细胞，用PBS洗涤3-4次。收集非粘附细胞，并冷冻。加入2毫升/ DC含1000 U / mL的IL-4和GM-CSF 800 U / mL的。 </li><li> DC启动后3-4天，补充IL-4，加入100μL/孔含终浓度为1000U/mL IL-4和800 U / mL的GM-CSF和GM-CSF。 </li><li> 5-6天收获DC刮以及用移液管。计数的大细胞，离心5分钟@ 400×克。吸液媒体和重悬DC在2×10 6细胞/ mL的直流媒体。加入0.5 mL /孔24孔培养板。 </li><li>转导DC使用Ad5f35pp65的MOI为每个单元10传染性单位矢量。添加vector到24孔板的各孔中。孵育细胞1.5小时。 1.5小时后，加入1.5毫升/ DC媒体含1000 U / mL的IL-4，800 U / mL的GM-CSF，10 ng / mL的TNF-α，1μg/ mL的PGE-1，100毫微克/毫升IL-6，和10 ng / mL的IL-1β。这些细胞因子成熟的区议会。 </li></ol> 3。 EBV-LCL（从第0天开始）的生成<ol><li>含有5×10 6单核细胞的离心管。添加200μL浓EBV B95.8上清液和完整的媒体的1.8毫升的（RPMI + 10％FBS + 2mM的L-谷氨酰胺）含环孢霉素（1微克/毫升）。 </li><li>等分试样100μL的细胞分为10个孔的96孔板中，分为5口井和200μL。添加100μL完整的媒体+环孢素的孔中只有100μL的细胞。填写剩余的井用无菌水。 </li><li>饲料LCL每周和扩大从96孔板，24孔板后1〜2周。一个星期后，转移到T25烧瓶，并在随后的一星期转移到一个T75烧瓶中。在这个阶段，我们建议您冻结等分LCL。它通常需要1个月，以产生足够数量的LCL。 </li></ol> 4。 CTL启动 - 7天开始后的区议会<ol><li>嘉实区议会和30 Gy的照射。洗4 x和计数。 ：重悬直流在T细胞的介质，含人血清（45％RPMI，45％CLICK，10％人血清，2mM L-谷氨酰胺）@ 1×10 5个区议会/毫升。 </li><li>解冻从步骤2.2的非粘附细胞。洗涤细胞，并计数。重悬在2×10 6在含有人血清的T细胞介质的非贴壁细胞/ mL。加入10纳克/毫升的IL-7和IL-12，和5 ng / mL的IL-15。添加1毫升的细胞在24孔板上每孔。每孔加入1 mL的DC。填充空的24孔板的孔中，用无菌水。 </li><li>后7天，饲料和/或T细胞起始分裂细胞与T细胞的介质，含有人血清。 </li><li> T细胞后9-12天开始，冻结的T细胞，直到LCL准备。 </li><li> ØNCE LCL已经扩大，在T75烧瓶中传代，转导LCL 5分钟@ 400×g下离心。加入到细胞沉淀的载体在100传染性单位每个细胞的MOI。孵育1.5小时。 1.5小时后，重新悬浮在完整的媒体在5×10 5 LCL /毫升，并在24孔板中，每孔加入2毫升12 </li><li>术后第2天，收获LCL在40 Gy的照射。洗4 x和计数。重悬LCL在T细胞介质中含有2.5×10 5细胞/ mL的人血清。加入1 mL的LCL的24孔培养板每孔。此外，添加到的Grex40的培养装置，以及5 ng / mL的IL-15的5×10 6个 LCL 13 </li><li>收获的T细胞。离心机@ 400×g离心5分钟，吸出上清液，并重新悬浮在含有1×10 6个 T细胞/ mL的人血清的T细胞介质。加入5 ng / mL的IL-15，并加入1毫升/孔的T细胞（总数为1×10 6个 T细胞），已经在24孔板上的LCL。在的Grex40，带来介质的总体积达30毫升。 </li><li>每天3-4刺激后，如果细胞是汇合，然后将它们分割（板）1:1，并添加新鲜培养基中含50 U / mL的IL-2。如果他们不汇合，然后简单地吸½媒体和更换含50 U / mL的IL-2。在的Grex40，吸一半的媒体，更换新鲜的培养基，并添加50 U / mL的IL-2。 </li><li>在第7天，重复在步骤4.6，但使用的IL-2的刺激的天，IL-15的。 </li></ol> 5。代表性的成果按照GMP标准FDA批准的制造协议的示意图， 如图1所示。这个过程需要50天左右。典型的产生病毒特异性T细胞扩大预先存在的记忆T细胞，然而，脐血缺乏病毒经验丰富的T细胞，因此，我们需要素幼稚T细胞的体外方法。要做到这一点，我们使用的树突状细胞，以及细胞因子IL-7，IL-12和IL-15，必要产生病毒特异性。 经过3刺激，收率 ​​应该超过100×10 6个细胞。如果有足够的细胞是不可用时，可以进行额外的刺激，直到所需的号码的CTLs可用。这些细胞的大部分应该是CD3 +，CD4 +和CD8 + T细胞的混合物。应该有小于15％的NK细胞（CD3-/CD56 +）且小于1％CD19 + B细胞（ 图2）。 扩大的CTL识别的抗原病毒pp65从巨细胞病毒，六邻体和聚氯从腺病毒，以及众多的EBV抗原表达于EBV-LCL。测试时，酶联免疫斑点法，CTL分泌IFN-？响应于比不相干抗原（ 图3）的这些抗原。 ，CTL还应该裂解抗原肽脉冲目标这样的PHA爆炸。在51 Cr释放试验，CTL裂解LCL，CMVpp65脉冲和腺病毒六邻体和/或聚氯脉冲的目标，但不是脉冲与目标不相关肽（ 图4）。 <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig1.jpg" alt="图1。"/> 图1。生成多病毒特异性CTL从脐带血 。示意图显示CTL制造的全过程，从脐带血。首先，脐带血单核细胞分离出20％的馏分的分馏脐血单元。散货代保存中的5×10 6个细胞的异常，然后，所有的细胞铺板在树突状细胞的介质为1-2小时，在该点的非粘附细胞的收获和冻结。的DC，然后输入DC媒体中IL-4和GM-CSF。经过5天的文化，是成熟的DC和巨细胞病毒抗原的免疫细胞病毒pp65的腺病毒载体转导的。发起，这些DC的非贴壁细胞，以及细胞因子IL-7，IL-12的结合，和IL-15。在随后的刺激，使用相同的腺病毒载体转导EBV-LCL，被用作抗原呈递细胞。 IL-15是用于在第二次刺激和其后的IL-2。 <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig2.jpg" alt="图2。"/> 图2。产生的T细胞表型 。所示出的是活细胞的百分比，在淋巴细胞门控。 CTL是CD3 +，CD4 +或CD8 +，但主要CD3-/CD56-和CD19-。 <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig3.jpg" alt="图3。"/> 图3的T细胞的功能 。由IFN-γELISPOT的T细胞特异性进行了测试。脉冲跨越整个六邻体蛋白，聚氯，病毒pp65的重叠肽，T细胞和不相关的抗原IE-1。 CTL单独表示单独的媒体。自体LCL照射，并添加1×10 5 /孔。显示的是的平均斑点形成细胞C指望。2-15的三个孔。 <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig4.jpg" alt="图4。"/> 图4的CTL的细胞溶解活性 。所得的CTL裂解表达病毒抗原的目标的能力进行了测试中的51 Cr的检测。，跨越整个抗原或51 Cr-标记的自体LCL与CTL共培养的重叠肽脉冲的51 Cr-标记的自体的PHA爆炸。 4小时后，γ释放γ计数器上计数。

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	<li>Kennedy-Nasser, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+outcome+of+alternative+donor+and+matched+sibling+donor+hematopoietic+stem+cell+transplant+for+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+in+first+or+second+remission+using+alemtuzumab+in+a+myeloablative+conditioning+regimen.">Comparable outcome of alternative donor and matched sibling donor hematopoietic stem cell transplant for children with acute lymphoblastic leukemia in first or second remission using alemtuzumab in a myeloablative conditioning regimen.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1245-1245 (2008).</li><li>Hanley, P. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+T+cells+targeting+multiple+antigens+of+cytomegalovirus,+Epstein-Barr+virus+and+adenovirus+to+provide+broad+antiviral+specificity+after+stem+cell+transplantation.">Expansion of T cells targeting multiple antigens of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and adenovirus to provide broad antiviral specificity after stem cell transplantation.</a> Cytotherapy. , (2011).</li><li>Gerdemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Multivirus-specific+T+Cells+to+Prevent/treat+Viral+Infections+after+Allogeneic+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplant.">Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant.</a> J. Vis. Exp. 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作者有没有透露。

<html>目的是在控制病毒感染后，CBT目前的战略是有效的，但他们都与显著的毒性，价格昂贵，并且不授予长期保护，对以后的感染。事实上，一些抗病毒药物的使用可能会限制病毒特异性T细胞，否则将保护的膨胀。14另一种选择是来自供体的病毒特异性T细胞的输注。我们和其他人表明，这种T细胞是安全，有效和符合成本效益的。15日至17日在这里，我们表明，这种方法也可以扩展...

<table border="1"><tbody><tr><td> 试剂名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen公司</td><td> 21870-076 </td></tr><tr><td> DC媒体</td><td> CellGenix </td><td> 20801-0500 </td></tr><tr><td> EHAA（点击的中等） </td><td> Irvine Scientific公司</td><td> 9195 </td></tr><tr><td>人血清</td><td>双子座生物制品</td><td> 100-110 </td></tr><tr><td>透气性Cultureware 18 </td><td>威尔逊狼</td><td> 80040S </td></tr><tr><td> IL-2的</td><td>凯龙（TCH药剂） </td><td></td></tr><tr><td> IL-12的</td><td> NCI / CTEP的</td><td></td></tr><tr><td> IL-15的</td><td> CellGenix </td><td> 1013-050 </td></tr><tr><td> IL-7的</td><td> R＆D </td><td> AFL207 </td></tr><tr><td> IL-1β </td><td> R＆D </td><td> AFL201 </td></tr><tr><td> IL-6的</td><td>细胞Genix </td><td> 1004-050 </td></tr><tr><td> GM-CSF </td><td> TCH药剂</td><td></td></tr><tr><td> IL-4的</td><td> R＆D </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/AFL204.pdf" target="_blank">AFL204</a> </td></tr><tr><td> TNF-α的</td><td> R＆D </td><td> AFL210 </td></tr><tr><td> Ad5f35pp65 </td><td> BCM CAGT载体生产设施</td><td></td></tr><tr><td>等离子传输带阴Luer适配器</td><td> “联合国宪章”医疗</td><td> 89-550-66J </td></tr><tr><td>淋巴制剂</td><td>奈科明</td><td> 1114550 </td></tr></tbody></table>

expanding cytotoxic t lymphocytes from umbilical cord blood that target cytomegalovirus, epstein-barr virus, and adenovirus

干细胞移植后的病毒感染是最常见的死亡原因，尤其是在脐带血（CB）移植（CBT），CB不包含相当数量的病毒有经验的T细胞可以保护收件人感染。1 -我们和其他人表明，病毒特异性CTL产生的血清学阳性的捐助者，并注入到收件人的安全和保护。5-8然而，直到最近，病毒特异性T细胞不能产生脐带血，可能是由于病毒特异性记忆T细胞的缺乏。 为了更好地模仿体内吸幼稚T细胞的条件，我们建立了一个方法，该方法使用CB来源的树突状细胞（DC）的腺病毒载体（Ad5f35pp65）含有的免疫CMV抗原病毒pp65转，因此驱动T细胞特异性对巨细胞病毒和腺病毒。在开始，我们利用这些马捕获区议会，以及CB来源的T细胞的细胞因子的存在下，IL-7，IL-12和IL-15。[10]在所述第二刺激我们使用EBV-转化的B细胞，或EBV-LCL，同时表达潜在的和裂解EB病毒抗原。 ad5f35pp65转导的EBV-LCL是用于刺激的T细胞中的IL-15的存在，在第二次刺激。后续的刺激使用Ad5f35pp65转导的EBV-LCL和IL-2。 从50×10 6 CB单核细胞中，我们能够产生向上的150×10 6病毒特异性T细胞，裂解抗原脉冲的目标和释放细胞因子响应于抗原刺激11将这些细胞在GMP兼容的方式制造，使用仅分馏脐带血单元分数的20％，并已被翻译供临床使用。

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Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

在这里，我们描述的第一个好生产质量管理规范（GMP）标准的方法从脐带血幼稚T细胞的来源主要是病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。

扩大目标，脐血细胞毒性T淋巴细胞，巨细胞病毒，EB病毒，腺病毒

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

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Immunology and Infection

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