This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.

注：以下步骤是按照批准的动物护理的加拿大议会的指引。所有的努力都是为了尽量减少在手术过程中的痛苦和动物的痛苦。 1，涂料的过滤器注意：当培养过滤器滤芯被放置在多孔板的孔中，两个隔室被定义：顶部隔室插入件上面的区域和底部隔室是插入图1A.ab低于1。外植体接种在顶部室，​​其中它们附着到过滤器的顶侧;许多轴突生长穿过过滤器并延伸于过滤器的底侧，底室图1A.c内。标准工作体积（ 即用于将涂布液，洗涤液，培养基，等等）是2毫升的底部隔室和1ml的顶部隔室和将要在协议中被称为“;标准卷“。加通过将移液管的尖端在插入和阱的侧面之间的间隙开始的底部隔室的解决方案。另外，倾斜插入到一侧，而分配的解决方案，以防止气泡被截留在过滤器的底部。 <ol><li>开始电镀的前一天涂覆的过滤器。在无菌组织培养罩，放置24毫米过滤器滤芯在6孔接收板。孵育刀片与聚-D-赖氨酸的水溶液（1毫克/毫升）1小时，在室温下使用标准卷：2毫升在底室和1ml的顶部。 </li><li>吸聚-D-赖氨酸和用清水冲洗一次。吸出的水，盖上盖子，离开板在引擎盖的O / N。干在液体吸出，一定要去除的液体残余的成为直属过滤器捕获。 </li><li>第二天早上，层粘连蛋白稀释在水中（10微克/毫升），混合和温暖在37°C。孵育刀片，层粘连蛋白1个小时的CEL升培养箱中37℃下，使用标准卷。 </li><li>吸液层粘连蛋白和胶原蛋白加水（0.1毫克/毫升）并保温1小时，在室温。在这种情况下使用2毫升的底部隔室和2ml的顶室中。 </li><li>吸胶原蛋白并用无菌水冲洗一次。该过滤器现在已经准备好接受文化媒体和背根神经节外植体，如步骤3中所述。 </li></ol> 2，解剖胚胎背根神经节（DRG）植<ol><li>由IP注射圣阿韦坦（250毫克/千克）的麻醉为期13天的怀孕雌性小鼠。等待10-15分钟，并检查是否缺少角膜和踏板撤出反射。一旦反射消失，进行颈椎脱位。 </li><li>消毒所有手术器械和女性腹部用70％乙醇。允许工具晾干。保持腹部的皮肤和切断通过皮肤和肌肉层，以暴露腹腔。 </li><li>从宫颈和卵巢分离切除子宫。在免缝勒罩，从用剪刀子宫取出胚胎和收集它们在培养皿中充满了冰冷L15介质。置于冰上。 注：请参阅有关进一步详情，有关如何获得13天的妊娠期17,18的胚胎先前的技 ​​术报告。 </li><li>在显微镜下，躺在一边的胚胎，并使用小弹簧剪刀去掉头部。使沿侧面切口丢弃胸部，腹部，四肢和尾巴。保持背部含脊椎，躺在腹侧，并删除所有内脏器官。 </li><li>用小弹簧剪刀，从沿中线其腹侧切开脊柱暴露了整个脊髓。握住胴体下来与一对镊子（＃3），并使用第二对通过其最喙方面保持脊髓。 </li><li>慢慢地，轻轻地拉扯电源线远离脊椎腔和夹断采用超薄钳（＃5）从脊髓病种付费。集团按病种付费，以收集有关在盘子的底部。 </li><li>通过用200微升的枪头，已被切割，以扩大其开放吸气收集分组病种付费。放置的DRG中的管和直到DRG收集完成在冰上离开。 注：白色/透明秘诀是首选，因为病种付费不遵守这个技巧的墙壁（相对于标准黄芽）。有媒体法拉盛提示使用前进一步防止病种付费粘到墙壁。 </li></ol> 3，播种和背根神经节外植体的维护上过滤器<ol><li>在37℃下加完整的DRG媒体使用标准量的涂层刀片。与NGF的15纳克/毫升补充底部隔间介质，同时保持顶部隔室NGF-免费。 注：虽然NGF有效扩散穿过过滤器和小时内其浓度达到平衡，我们已经观察到应用NGF在车厢底部直接播种前显著增加在B轴突产量过滤器的ottom表面。 </li><li>从管使用1,000微升移液器与修整，以扩大其开放小费转移病种付费的过滤器。 </li><li>采集病种付费之前绘制介质插入针尖2到3倍。这防止它们粘到尖端的内侧。相同的尖端可以被重新用于所有的孔中。使用未着色的技巧（与标准蓝色提示）降低DRG粘在针尖表面。 </li><li>转移病种付费，设置吸管在800微升。自吸过滤器的顶部约200微升的媒体，然后去含DRG管和吸管小音量上下 - 重悬已经沉入底部病种付费。吸出整个体积和吸管病种付费淹没尖端插入中间。 </li><li>一旦所有插件被加载，关闭板盖，摇动板10倍，每个涡流之间的引擎盖板凳上轻轻拍打它。这些运动帮助提高产量轴索DRG外植体下沉和连接到过滤器。这也有助于分散均匀植让不同外植体的轴突不重叠。 注：在前面的步骤中描述的外植体接种程序外植体附着的整体比率显著增加至基板（高达75％）。最显著，移液过程容易地防止从外植体浮在介质表面而不是沉到所述插入件的底部。 </li><li>对于生化分析，种子按病种付费的过滤器每一个胚胎（约30）。对于形态分析，可以使用一半或三分之一的病种付费，从一个胚胎（10-15）。收集的DRG成管之前必须作出这样的决定，从而使管的所有的DRG接种到一个单一的孔（不管是30，15或10的DRG）。 </li><li>保持文化在细胞培养箱中37℃，变化的媒体每2-3天。更换介质，第一抽吸车厢顶部，随后是底部隔室。加入新鲜的培养基中标准体积天开始与车厢底部。 注：为了防止细胞/神经轴突从干燥，不要在超过3刀片同时更换介质。在NGF的存在生长在过滤器按病种付费将延长长轴突，在培养2天达到了2毫米。 </li></ol> 4，营养因素放弃治疗神经生长因子撤出诱导轴突变性与轴突碎片首先出现大约12小时后停药（如果相衬和β-III-微管蛋白测定）。完整的碎片是由36小时实现的。多长时间的退化是留给继续进行，必须由最终用户根据实验设计选择。 <ol><li>为期2天的轴突延伸阶段后，从顶部和底部隔层缺乏NGF和含有抗神经生长因子抗体（1微克/毫升），以隔绝任何剩余（或内源性）神经生长因子改变媒体介质。 </li><li>返回板，细胞培养箱（37℃），以允许NGF戒断诱发的变性进行对时间的期望的量。 </li><li>继续蛋白提取（步骤6）审议通过免疫印迹或中频（第7步）直接检查过滤器。 </li></ol> 5，轴突横断来诱导沃勒变性此程序离开轴突上从它们的细胞体分离的过滤器的底侧，但在其他完好。此后，这些轴突迅速启动Wallerian变性。轴突碎片横断后首次出现了3个小时（如果相衬或β-III-微管蛋白的证明）; 9小时，轴突是完全分散，从过滤器被分离。多长时间的退化是留给继续进行，必须由最终用户根据实验设计选择。 <ol><li>刮除过滤器的顶侧，含有生长的DRG外植体，用细胞刮刀破碎。在X轴，Y轴和圆形运动着的刮板确保完全去除顶部材料方向。 </li><li>从含有已被刮离过滤器并更换为1ml含有NGF（10纳克/毫升）预热，完整的DRG媒体的浮动外植体的顶部隔室丢弃媒体。 </li><li>返回板对细胞培养箱中（37℃），以允许Wallerian变性进行的时间由最终用户选择的量。 </li><li>继续蛋白提取（步骤6）审议通过免疫印迹或中频（第7步）直接检查过滤器。 </li></ol> 6，轴突蛋白样品的提取<ol><li>填收集管（1.5毫升）与75微升Laemmli样品缓冲液中。保持管在冰上，而从整个一套过滤器收获轴突。 </li><li>用在PBS中的DRG外植体洗涤过滤器和刮除器的顶侧。从板中取出刀片，清洁过滤器的顶侧用棉尖涂药和从顶侧和底侧吸任何额外的PBS。 </li><li>将插入上攻下来的长凳上，用锋利的手术刀切滤出的插入。握住过滤器镊子，自下而上。做一个切口从周围到过滤器的使用剪刀的中心。 </li><li>在收集管上放置过滤器，并用血管钳，按中央过滤器的下管。虽然这样做，一个漏斗应形成。推漏斗形过滤器，以在管的底部，以便它浸没在Laemmli样品缓冲液中。 </li><li>完整蛋白质提取煮沸管4分钟。使用镊子将其置于倒置​​在管的顶部和执行简短的自旋（2000×g离心15秒）除去的过滤器。丢弃干燥过滤器。 </li><li>解决10微升的轴突蛋白制备的SDS-PAGE电泳后免疫印迹检测感兴趣的蛋白质。 注意：作为一个参考，从生长2天，并溶解在100μlRIPA 20外植体的轴突制备裂解缓冲液将4-6的蛋白质浓度微克/微升。 </li></ol>轴突7。对过滤器免疫荧光检查以下步骤概括的一般操作来执行中频染色的过滤器滤芯，β-III-微管蛋白的检测例证。固色剂，孵育时间，浓度及其他详情，应为其他抗原 - 抗体对进行优化。 <ol><li>利用以前使用的6孔板中，彻底清洗，对刀片的下面的洗涤和孵育。 </li><li>在PBS中简要地洗刀片。解决他们在PBS新鲜配制的4％多聚甲醛在室温在摇床上10分钟。 </li><li>固定后，刮去和清洁刀片的顶侧，以收集只生长在过滤器的底表面上的轴突。继续孵育标准中频。 </li><li>在封闭溶液（TBS，0.05％吐温20,5％脱脂奶粉），使用标准的卷，1小时，在室温下轻轻摇动孵育插入。 </li><li>转让插入到稀释于封闭缓冲液（抗β-III-微管蛋白，1:5000），使用标准的卷初级抗体。孵育的O / N（约18小时），在4℃下轻轻摇动。 </li><li>在PBS中（2×10在RT（分钟））洗两次第一抗体。 </li><li>转让插入到稀释于封闭缓冲液（山羊抗小鼠，1:2,000），使用标准的卷荧光标记的二抗。孵育涵盖了从光2小时在室温轻轻摇动。 </li><li>在PBS（3×10在RT（分钟））洗二次抗体3倍。 </li><li>如果完成后，需要插入出去，倒掉PBS从最后一次洗涤和清洁过滤器的上侧用棉尖涂药。从顶侧和底侧抽吸的液体。 </li><li>地方插入板凳上颠倒，切滤出的插入用锋利的手术刀。 </li><li>握住过滤器镊子，下行起来，并将其放置在载玻片。覆盖盖玻片和荧光兼容谋nting媒体。让干扁在寒冷的房间，涵盖了从光。检查并用荧光显微镜拍摄的图像。 注意：当储存在4℃下并避光下，这些制剂可以保持周与荧光的损失最小。 </li><li>可选：另外，如果能在已经从插入取出过滤器进行。要做到这一点，凑和固定后直接清洗过滤器的顶部。 <ol><li>采取过滤器出来的刀片与一个6孔板的底部锋利的手术刀和地方过滤器的轴突式。 </li><li>此后，在7.4-7.8和7.11所示为中频进行孵化。这种替代的优点是，它可以节省试剂，因为，例如，孵化卷可以下降到500微升（相比于使用时，过滤器被直接染色的插入，如图7.1-7.11 3毫升）中。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

重要参数适应这种技术时要考虑到包括神经元群，将待研究的衬底，所述过滤器的孔径大小和表面积。所有这些参数会影响所获得的神经突制剂的特异性，质量和数量，并且必须由最终用户仔细考虑。在此协议中提出的例子，使用DRG神经元具有延伸仅轴突，从而给出纯的（特定的）轴突制剂的优点。 胚胎病种付费的轴突生长是非常快的比较，从中枢神经系统的神经元，使轴?...

神经元的轴突舱显示了很大程度的躯体树突状隔间功能独立的。在投射神经元，轴突包含了大部分神经蛋白1,2。轴突的生理和病理生理的研究已经获得了在神经科学界的势头，因为最近的研究表明，早期轴突功能障碍似乎是神经退行性疾病和神经精神障碍3的 ​​一个共同特征。这很可能是一个更好地了解正常和病理条件下轴突独家机制将揭示早期事件驱动功能障碍灯。 本协议描述了如何使用培养插入轴承的多孔膜（过滤器），以获得大量的纯粹性轴索材料，适用于生化和免疫组化分析。使用过滤器的插入，研究轴突生物学最早是由管家和实施同事4，并进一步向它的当前配置开发的特维斯和他的同事5。该技术现在处于当前使用通过研究轴突和树突生物学的不同方面，在每种情况下轻微的修改，以适应研究神经细胞的群体，所执行的处理和生物化学分析的类型，使用6-9。本协议不打算以适应这样的各种应用程序的所有备选方案，而是提供了一个简单的方法，是适用于大多数应用。特别是，这里所描述的协议使用三重涂层，最大限度地提高产量轴索用于生化分析和是研究文献中描述的轴突变性，其它涂层最合适的生产小于缩回和退化速度从营养因子剥夺9时轴突。 在此过程中，神经元细胞体保持隔离之上的过滤器的wh异亮氨酸的轴突穿过的孔，并沿其底表面上生长。纯轴突（免费神经胶质细胞和神经元细胞体污染物）在过滤器的底部表面生长，可用于采集生化分析或可固定在原位 ，并通过免疫细胞化学技术检测9。该过程依赖于使用胚胎感觉神经元从背根神经节（DRG）。胚胎背根节被广泛地用于研究轴突生物学，因为来自这些细胞的神经突起进行体外快速和强劲增长时，在神经生长因子（NGF）保持，并且当失去这个因素，因为它们迅速地进行变性。此外，DRG神经元缺乏树突，以便所有通过这种方法收集的突起是纯粹的轴突。 过滤器滤芯代表相比，用于研究轴突其他方法有很大的优势。研究依赖于使用显微镜来区分发生在从那些在胞体的过程xons提供有限的生化信息。作为另一个例子，条块培养系统（ 例如 Campenot室10或微流体装置11）是用于成像的方法和差分处理细胞区室的有用的，但仅提供少量的轴突材料制成的，排除了使用这些技术对于需要生化分析相对大量的样品。此外，它们的使用需要显著培训，以及专业的设备，他们是费时。常用于植隔离轴突另一种方法是轴突样品采集之前手动删除植中心（含神经元胞体）。虽然这可以产生大量的轴突富集制剂，在该制剂的轴突可以笼罩在神经胶质细胞和来自6个孔中（如一个最小的实验的一个例子）快速除去20外植体的体连续是费时和可行性的限制。 与此相反，这里提出的方法产生，然后可以通过几乎任何生化技术，通常被用于分析全细胞溶胞产物，如蛋白质印迹，免疫沉淀6，northern印迹5质谱6，RNA纯化进行分析丰富和纯轴索制剂7,12,13，等等。此外，该协议可以用于免疫荧光（IF）的技术，因为它可以固定轴突在过滤器的底侧上生长由中频进一步加以研究。这种方法大大方便了轴突的具体过程的分析，因为没有细胞体中的最后准备。这是一个显著的优势，因为从细胞体高免疫荧光信号往往破坏检查和较弱的信号由薄的结构，如神经轴突起源的分析。 两个应用程序的培养方法，研究轴突变性ARE中所述;发育修剪和损伤引起的退行性变的模型的模型（通常被称为Wallerian变性）。发育修剪的造型是基于一个事实，即在体 ​​内的感觉神经元竞争限制目标源性神经生长因子和金额那些未能得到足够的神经营养支持简并14。这种现象可以通过从培养基中，其中，因为发生在体内 ，启动轴突变性，然后进行细胞体破坏吸NGF来模拟在胚胎背根神经节培养物。建模Wallerian变性，过滤器与细胞体的顶侧被刮掉。这已经增长到过滤器成为从细胞体物理上分离并随后经受谁最先报道的现象在1850年16称为Wallerian变性15的快速和刻板退化过程，A.沃勒命名后的底侧的轴突。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">CD-1 mouse, E13 timed pregnancy</td>
			<td style="width:140px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:416px;">In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Cell Culture Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353102</td>
			<td>1 &#181;m pore size, fits 6-well receiving plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Cell Culture Companion Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353502</td>
			<td>Receiving plates for inserts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td>Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td style="width:416px;">Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 &#176;C and thaw overnight at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureCol Bovine Collagen Solution</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>Can be replaced by DMEM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 Serum-Free Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine (FDU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGF (2.5S, beta subunit)</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CLMCNET-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="109" rowspan="2" style="height:109px;width:297px;">Anti-NGF Antibody</td>
			<td style="width:140px;">Prepared in-house</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:416px;">As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. &#38; Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alomone Labs</td>
			<td style="width:119px;">AN-240</td>
			<td>Commercial option</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Tubulin Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DRG culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:297px;">Neurobasal Medium 
			2 % B27 Neurobasal Supplement 
			2 mM l-Glutamine 
			1 % Penicillin-Streptomysin 
			10 &#181;M FDU 
			15 ng/ml NGF (bottom compartment only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Laemmli Sample Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:297px;">10 % SDS 
			0.5 M DTT 
			0.5 M Tris (pH 6.8) 
			5 % Glycerol 
			0.01 % (w/v) Bromophenol blue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and isolation of axons from sensory neurons for biochemical analysis using porous filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

从E13.5小鼠背根神经节外植体长出了大量关于过滤器依次涂有聚-D-赖氨酸，层粘连蛋白和胶原蛋白（ 图1B，左），达到了2毫米内培养2天。该基板组合产生特别旺盛的增长;其他组合产生的轴突是相当短（ 图1B，右）。此外，在保持病种付费的过滤器比延长生长在塑料图1C病种付费更多和更长的轴突。 过滤器具有1微米的直径，在该协议中使...

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Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

生产和轴突隔离从感觉神经元的生化分析使用多孔过滤器

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

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14.1K 次观看.  Montreal Neurological Institute, McGill University. This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration. 