此方法有助于产生大量感兴趣的重组RNA，用于研究或工业。主要优点是重组RNA在大肠杆菌中产生，其成本低廉，易于放大。重要的是，RNA产生于圆形RNA支架上，有助于纯化到同质性。
与DNA或蛋白质相比，感兴趣的RNA在生物工厂系统中不容易产生大量，例如大肠杆菌培养。我们的方法基于将感兴趣的RNA的共表达插入到高度稳定的圆形基架中，并应用一种连接RNA循环的连体。圆形RNA支架源自获得专利的振动机器人。
病毒是相对较小的，非线圈，高度基对对的圆形RNA，对一些更高的植物具有传染性。我们可以在常规的实验室条件下，每公升细菌培养产生几十毫克的重组RNA。要开始此过程，请按文本协议中概述的 PCR 放大 cDNA。
接下来，在0.5毫升管中加入100毫微克质粒pLELVd-BZB。加入10U型IIS限制酶BpiI和足够的缓冲G，形成20微升反应。在37摄氏度下孵育一小时，消化质粒。
在此之后，在TAI缓冲液中用1%的阿加糖凝胶中电泳分离PCR和消化产品。以每毫升0.5微克的浓度摇动200毫升溴化乙基基，将凝胶染色。使用紫外线转光器，可视化DNA。
使用手术刀切出与放大的cDNA和BpiI消化质粒对应的带子。使用硅胶柱，从凝胶片段中分出DNA。通过分光光度测量分析量化DNA的浓度。
使用放大的 cDNA 和消化的质粒建立吉布森组装反应。在50摄氏度下孵育一小时。然后，使用硅胶柱来净化反应。
电选合格的大肠杆菌DH5-Alpha细胞后，选择几个白色菌落，并转移到液体LB介质。在37摄氏度下过夜生长的殖民地。接下来，使用迷你预发套件来净化质粒，并在 TAE 缓冲液中用 1% 的 agarose 凝胶通过电泳分析其大小。
首先，使用含有与感兴趣的RNA对应的cDNA和质粒P15LTRNISM共同表达茄子tRNA连结酶的pLELVd-BZB导数，共同对选定的大肠杆菌菌株进行共电。将S、C液体介质转移到电穿孔中以回收细胞，并在37摄氏度下孵育一小时。然后，将细菌板在LB固体介质上，每毫升安他西林含有50微克，每毫升氯霉素含有34微克。
一夜之间在37摄氏度下孵育。第二天，在一升的Erlenmeyer烧瓶中加入250毫升的液体TB介质，每毫升含有50微克的安皮西林，每毫升氯霉素含有34微克。取回孵化的大肠杆菌，然后挑选一个菌落，在烧瓶中接种介质。
在37摄氏度下孵育，在180 RPM下剧烈摇晃12至16小时，然后采集细菌。将收获的E.Coli培养剂倒入250毫升的离心瓶中，以14000G的基转10分钟。丢弃上一杯，将细胞重新在30毫升水中。
将此悬浮液转移到离心管中，并使用以前的条件再次旋转电池。丢弃上流剂，向细胞颗粒中加入10毫升色谱缓冲液。漩涡以重新填充缓冲器中的细胞。
大力加入一卷酚:氯仿和涡流，以破坏细胞。然后，在12，000G下离心10分钟。恢复水相，加入一卷氯仿，并大力涡流。
在12，000G下离心10分钟。在此之后，通过 45 微米注射器过滤器过滤 RNA 制备。使用连接到液相色谱系统的一毫升二乙基乙醇胺柱净化RNA。
将流速调整为每分钟 1 毫升，并用 10 毫升色谱缓冲液平衡柱。然后，加载样品，用 10 毫升色谱缓冲液清洗柱。用20毫升洗脱缓冲液洗取RNA，并收集1毫升等同。
使用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳，将圆形RNA与线性RNA分离。首先，在TBE缓冲液中准备5%的聚丙烯酰胺凝胶，并含有8个摩尔尿素，如文本协议中所述。将 20 微升RNA制剂与一卷加载缓冲液混合。
在95摄氏度的加热块中孵育1.5分钟，然后在冰上捕捉冷却。将样品装在聚丙烯酰胺凝胶中，并在凝胶尺寸的适当条件下运行电泳。在此之后，将凝胶染色为每毫升0.5微克溴化乙基，15分钟。
用水清洗染色凝胶，然后在紫外线下将RNA可视化。与pLEVd-BZB相比，对插入不同cDNA的几种重组质粒进行电泳分析，显示迁移情况不同。请注意，pLELVd-BZB 包含 lacZ 标记，该标记由与感兴趣的 RNA 对应的 cDNA 替换，因此，虽然迁移确实取决于插入的 cDNA 的大小，但重组质粒的迁移速度通常比控制质粒快。
通过破坏细胞和通过变性页面分析RNA来监测共电分培养物中重组RNA的产生。可以看到强频带，它们对应于空的ELVd和嵌合ELVd形式，其中插入了不同的感兴趣的RNA。有趣的是，重组RNA的主要部分被视为圆形。
在高离子强度和低离子强度的变性条件下，使用两个PAGEs的组合来观察主要分数的循环性。RNA制剂可以通过腺质交换色谱进一步纯化。如这里所见，E.Coli RNA在低离子强度下有效保留，随后在高离子强度下洗出，大部分RNA以第二和三分数收集。
重组RNA可以通过二维电泳进一步纯化为均匀性。该协议允许通过最终产品的循环性，在大肠杆菌中轻松生产大量重组RNA，并纯化为均匀性。请记住，感兴趣的RNA结果嵌入到从植物振动机器人衍生的圆形RNA支架中。
如果您希望分离这两种生物，则需要使用标准策略，如核糖核素、DNAzymes 或 RNase H. 此协议的产生取决于感兴趣的特定 RNA，因为小型RNA的生成量可能高于较大的RNA。对于较大规模的表达，考虑到收获细菌的最佳时间取决于许多因素，包括大肠杆菌菌株、培养基和生长条件。我们建议进行初步时间测试，以找到特定条件下的最佳生产窗口。
请记住，重组RNA在细菌细胞中短暂积累，并在生长后期完全消失。
