利用 tap 标签纯化叶绿体转移蛋白配合物的亲和纯化

该方法有助于回答叶绿体领域关键问题，例如叶绿蛋白进口机械的组成。它对于绿化和光合作用至关重要，因此对于地球上的粮食生产也至关重要。分子机由两个独立的复合物组成，在叶绿体的外层和内层，称为 TOC 和 TIC，但组成不完全知道。

该技术的主要优点是，Arabidopsis TOC/TIC复合物的纯化可以通过单步纯化方法（TAP-TOC）完成。这是一种具体而有效的方法。一般来说，新采用这种方法的研究人员可能难以为之，因为他们不熟悉叶绿体膜分数的分离、洗涤剂、溶解或亲和力纯化。

在制备了阿拉伯植物后，用液氮研磨10克3周大的幼苗，用冷砂浆和沙子来刺。向地面组织添加 20 毫升的冷磨缓冲液。混合好，让混合物在冰上解冻。

接下来，用研磨缓冲液浸泡两层快速过滤材料。通过两层过滤材料将均质过滤到 50 毫升锥形离心管中。将滤液在4摄氏度的1，500倍g下离心10分钟，然后将上流液转移到一个新鲜、预冷的50毫升锥形离心管中。

在相同条件下再次重复离心。将上清液转移到冷的 38.50 毫升超离心管中，用冷磨缓冲液将其加到 35 毫升。使用超离心机将样品在10万次g和4摄氏度下离心一小时。

使用玻璃特氟龙均质器，在研磨缓冲液中重新填充绿色颗粒。在10万倍的g和4摄氏度的温度下离心一小时，然后丢弃上一代。使用玻璃特氟龙均质器将绿色颗粒重新在 18.75 毫升的 x 研磨缓冲液中重新下水。

然后再添加一个 x 研磨缓冲液的 9.375 毫升。加入 4 个 x 溶解溶液的 9.375 毫升，使最终体积达到 37.5 毫升，并在 4 摄氏度的旋转摇床上孵育 30 分钟。在此之后，使用超离心机将样品以10万倍g和4摄氏度离心一小时。

将含有溶解膜的上流液转移到一个新的 50 毫升锥形离心管中。制备 IGG agarose 树脂后，将先前洗涤的 IGG agarose 树脂转移到含有 37.5 毫升溶解膜的 50 毫升锥形管中。在四摄氏度的旋转摇床上孵育过夜。

第二天，IGG加糖树脂在100倍g和4摄氏度的沉淀5分钟。使用移液器去除上流液。是 IGG agarose 树脂在 37.5 毫升缓冲器 A 中，并在室温下在旋转摇床上孵育 10 分钟。

继续沉淀和清洗树脂，如文本协议中所述。在此之后，将 IGG agarose 树脂转移到 500 微升旋转柱中，并配有 35 微米过滤器。用 300 微升 TEV 洗脱缓冲液清洗珠子两次，以进行平衡。

接下来，添加300微升的TEV洗脱缓冲液，包含10微升的TEV蛋白酶。在 16 摄氏度和 350 rpm 的热混合器中用珠子孵化旋转柱两个小时。然后，打开旋转柱，并放在一个新的，干净的，1.5毫升的管。

旋转这个管在100倍g和4摄氏度5分钟收集水卢酸盐。在这项研究中，一个TATA标记叶绿体包络蛋白复合物从转基因的阿.塔利亚纳植物被纯化。免疫布洛特分析证实，分离的TATA-TOC159与 TOC 综合体的 TOC75 和 TOC33 相互作用。

众所周知的氯层外膜激酶KOC1也是共分离的。TIC110 的存在表明，隔离的 TAP-TOC159 复合体还包含 TIC 复合物的组件。FBN1A抗体无法识别TATA-TOC159复合物，表明不存在污染。

在阴性对照中，免疫沉淀的NTAP蛋白没有与任何 TOC、TIC 蛋白共同分离，并确认 TAP-TOC159纯化的特异性。虽然这种方法可以提供叶绿素蛋白进口的见解，但它有可能应用于阿拉比多普西沙利安娜瓶系统中的任何其他复合物。按照此过程，可以应用其他方法，如西印迹或质谱法，以证明已知组件的存在或识别 TOC 和 TIC 复合体的新组件。

该技术为叶绿体蛋白导入领域的研究铺平了道路，以探索 TOC 和 TIC 复合物新成分的功能。