用于研究拉帕霉素/mTOR相互作用的半定量药物亲和反应目标稳定性 （DARTS） 测定

药物亲和力反应目标稳定性，DARTS，是检测新型小分子蛋白靶点的一种稳健方法。它可用于验证已知的小分子蛋白相互作用，并找到天然产品的潜在蛋白质靶点。在这项研究中，我们通过监测蛋白质稳定性的变化和估计蛋白质配体相互作用的亲和力，进一步增强了DARTS实验的数据分析能力。

蛋白质配体相互作用可以根据两条曲线绘制，一条蛋白解曲线和一条剂量依赖曲线。我们使用 mTOR-rapamycin 交互作为建立协议的典范案例。使用DMEM生长293T细胞，使用10%的胎儿牛血清、两毫升谷氨酰胺和1%抗生素。

在37摄氏度的二氧化碳下孵育。当培养达到80-90%汇合时，用冷PBS清洗细胞两次。使用细胞刮刀将细胞收集到适当数量的冷细胞解解缓冲液中，将解菌细胞转移到1.5毫米管中。

倒置混合解液缓冲液和解菌细胞，并在冰上孵化管子10分钟。在4摄氏度下，将管子以18，000倍g离心10分钟。将上一液转移到新的1.5毫升管中，并在冰上冷藏。

执行 BCA 测定以近似于 lysate 的蛋白质浓度，并基于蛋白质浓度计算蛋白酶的稀释。首先，将酸盐转移到两个1.5毫升管中，每个管99微升。在每个糖酸盐的一个分体中加入一微升的小分子库存溶液，并在室温下通过摇动孵育两个管30至60分钟。

在冰上，在1x TNC中建立新鲜解冻的蛋白酶溶液的连续稀释。与小分子孵育后，将每个等分分成5个管中的20微升样品。为了确保相同的消化时间，每30秒的特定间隔，在样品中加入两个微升的已准备前酶溶液。

对于一个控制组，添加两个微升的 TNC 缓冲区。5至20分钟后，通过每隔30秒加入两微升冷20x蛋白酶抑制剂鸡尾酒，停止6管的消化。混合好，在冰上孵育10分钟。

用 6 微升 5x SDS-PAGE 加载缓冲液稀释每个样品，并在 70 摄氏度的水浴中将样品煮沸 10 分钟。现在，要执行西式印迹，将等量的蛋白质加载到8%SDS-PAGE凝胶的井中，以及适当的分子量标记物中。在 80 伏电压下运行凝胶 30 分钟，然后将电压调整为 120 伏，然后继续运行 1 到 2 小时。

验证小分子能直接与潜在的靶蛋白结合。在此协议中，与小分子的孵育证实了对蛋白细胞分解的保护。发现三个带子在车辆控制上通过使用拉帕霉素进行孵育而受到保护。

西方印迹表明mTOR蛋白在低前酶与蛋白质比率中的存在，以及其减少和损失与增加的比例。由蛋白酶对mTOR的蛋白酶的蛋白酶明显抑制，拉帕霉素的存在和拉帕霉素的加入在蛋白酶曲线上产生了明显的变化。拉帕霉素剂量依赖性地提高了mTOR的水平，表明mTOR与拉帕霉素治疗的稳定性上升。

目标蛋白带强度的定量表明mTOR是拉帕霉素的目标蛋白。为了获得最佳的步进效果，本实验可能需要重复多次，以获得适当的蛋白比前鼻作用。