该协议允许用户研究免疫系统如何产生对病原体或组合微生物的抗体。此外，还可以利用转基因小鼠研究调节免疫球蛋白基因多样化的分子通路。该协议使用常见的分子生物学技术组合，包括PCR和桑格测序，不需要单细胞分拣或深测序。
派尔的补丁很容易与周围的脂肪组织混淆。因此，这种方法的视觉演示可能有助于那些不熟悉这个器官的人识别其位置并观察其解剖。首先将鼠标放在解剖垫上，腹部暴露。
慷慨地喷洒70%乙醇的老鼠的身体之前，作出任何切口消毒解剖区域。切入腹部的皮肤，用手指或钳子同时拉到切口的两侧。然后用剪刀切开腹腔，露出内脏。
找到小肠，并通过切开下面的胃和上方切除它。去除连接小肠褶皱的任何结缔组织和脂肪。检查小肠的外部表面，以发现Peyer的斑块，这是小椭圆形结构，在一层薄薄的半透明上皮细胞下呈白色。
用剪刀小心地切除所有可见的Peyer贴片，并把它们收集到一个1.5毫升的微型离心管中，其中含有一毫升的FACS缓冲器在冰上。如果收集的组织沉入管子的底部，它实际上是一个Peyer的补丁，而不是脂肪组织。将一个 40 微米的过滤器放在一个 6 个井盘中，配上 1 毫升冷 FACS 缓冲器，然后将 1.5 毫升管中的 Peyer 补丁倒入过滤器。
使用单毫升注射器的柱塞平端作为害虫，粉碎过滤器上的 Peyer 补丁，直到只有结缔组织保留。用一毫升冷FACS缓冲器清洗过滤器和柱塞，将细胞释放到六井盘中。收集细胞，并通过40微米滤网膜帽FACS管过滤它们。
然后用一毫升冷 FACS 缓冲器清洗滤网盖。在4摄氏度的600G下离心，将细胞分丸5分钟。然后去除超自然物，用FC块在0.4毫升的冷FACS缓冲器中恢复细胞。
在冰上孵化样品15分钟，然后清洗和颗粒细胞。要染色细菌中心 B 细胞或 GCBC，在 80 微升 FACS 缓冲器中恢复野生类型细胞。从野生类型 Peyer 的修补程序中取出 10 微升细胞，用于每个染色控制。
为实验样本留下40微升的细胞悬架。或者，使用补偿珠进行染色控制。在 500 微升冷 FACS 缓冲器中用 2.5 微升 PNA 生物素在冰上污渍每个实验样本 15 分钟。
然后清洗PNA污渍细胞。在黑暗中和冰上用 500 微升 GCBC 鸡尾酒将每个样品染色 15 分钟，确保细胞在鸡尾酒中完全恢复。要为补偿矩阵准备单个污渍控制，使用文本中指定的稀释剂将细胞染色在 500 微升的冷 FACS 缓冲器中。
在冰面上的黑暗中孵化染色控制器15分钟。添加两毫升冷 FACS 缓冲器以清洗所有污渍样品和控件。在将细胞重新悬念到最终体积为 500 微升的冷 FACS 缓冲器中以在细胞仪上运行之前，将细胞切开并丢弃超细剂。
然后，使用细胞分拣机从每个染色实验样本中收集 B220 阳性 PNA 高细胞。为了从Germinal中心B细胞或GCCC中提取DNA，在500微升的DNA提取缓冲器和5微升蛋白酶K中恢复细胞，然后用500微升的异丙酚和一微升的糖原沉淀DNA。将管子倒置五到六次，使管子彻底混合。
在室温下孵化样品10分钟后，在21，000G和25摄氏度下离心机15分钟。丢弃超自然，用一毫升70%乙醇清洗DNA颗粒。将DNA在21，000G中分离10分钟，然后去除乙醇，将颗粒空气干燥5至10分钟。
将DNA在30微升的TE缓冲器中恢复，并在56摄氏度下一夜之间孵育。为 JH4 因特龙执行嵌套 PCR。将第一个 PCR 中使用的基因组脱氧核糖核酸总量标准化为最不集中的样本。
在凝胶上运行 PCR 产品后，用凝胶提取套件清除放大器并净化。然后将放大器放入质粒中，然后用两微升的连体反应改造具有电的细菌细胞。电化细胞在1.65千伏，并抢救他们在600微升的SOC介质一个小时，在37摄氏度的震动孵化器在225 RPM。
将转化后的细菌的100微升板加到LB agar板上，辅以安培素，并在37摄氏度的温度下连夜孵化板。对细菌菌落中的血浆DNA进行测序，并使用 Clustal 欧米茄软件将每个 PCR 获得的序列与 JH4 Intron 参考序列对齐。将参考序列中的差异识别为突变。
通过测量B220受体的表达和花生凝胶素的结合，确定了Germinal中心B细胞。野生型派耶的斑块平均每只老鼠含有400万个细胞。大约8%的细胞是B220阳性PNA高，这是在AID淘汰小鼠观察到的一半。
在从野生型Germinal中心B细胞获得的105个独特的序列中，共发现了226个突变。对突变谱的分析显示，每对碱基对的过渡和转位版本速度为四倍10至负三次突变。在 113 个 AID 淘汰序列中只发现了两个突变。
此外，每个JH4 PCR产品从野生类型Germinal中心B细胞，包含一到25个突变与多个突变经常发现一个序列。在尝试此协议时，请记住将细胞保留在冰上，以保持细胞的生存能力。染色细胞后，将细胞保持在黑暗中，以防止荧光素的光漂白。
为了将体细胞突变与抗体亲和力成熟联系起来，我们建议使用免疫协议，并分析抗原特异性抗体滴定剂和V区域突变。
