本协议描述了化学变暗系统，以诱导端粒上的蛋白质凝结物。它可以很容易地适应诱导冷凝水在其他基因组位点，并适合探索染色质相关的冷凝水的形成和功能。该方法提供活细胞成像所需的时间分辨率，并维持生化测定细胞群的相分离。
首先，在 10 毫摩尔的 DMSO 中溶解变暗器，并将它们储存在零下 80 摄氏度的塑料微中心管中，以便长期储存。将10毫摩尔稀释剂在成像介质中稀释到10微摩尔的库存浓度，并储存在零下20摄氏度。当准备使用时，稀释稀释剂到生长介质或成像介质中最终工作浓度为 100 纳米摩尔。
种子10至第五细胞在12毫米直径的圆形盖眼镜涂上聚D-莱辛在六井板。然后用光环-GFP-TRF1和mCherry-eDHFR-SIM或mCherry-eDFR-SIM突变质粒转染细胞，等待24至48小时，然后继续免疫荧光。将稀释的100纳米摩尔稀释剂加入细胞中，在37摄氏度下孵育4至5小时。
孵化后，在含有4%甲醛和0.1%Triton X-100的PBS溶液中固定细胞，在室温下10分钟使细胞渗透。然后用 PBS 清洗细胞三次。清洗盖滑两次与50微升的TBS-Tx和一次与50微升的抗体稀释缓冲。
在潮湿的室内，用50微升原抗PML、抗SUO-1或抗SUO-2和3抗体在4摄氏度的隔夜孵化每个盖滑。用抗体稀释缓冲器清洗盖子三次，去除未绑定的主要抗体，然后在室温下用二级抗体在暗盒中孵育细胞一小时。染色后，用 TBS-Tx 清洗盖滑动三次。
通过添加每毫升 DAPI 一微克的两个微升标记幻灯片，然后翻转盖滑，并将其放置在 DAPI 掉落上。从盖滑边缘吸出额外的液体。用指甲油密封滑梯，使其干燥，并用水冲洗盖子顶部。
将幻灯片放在冰箱中直到成像。10号种子到第五细胞在12毫米圆形盖眼镜涂上聚D-莱辛在六井板，并转染他们与光环-TRF1和mCherry-eDHFR-SIM或mCherry-eDHFR-SIM突变质粒。在室温下用4%甲醛固定细胞10分钟，然后用PBS清洗4次。
对于IF-FISH，用初级和二级抗体染色细胞，并在室温下用4%甲醛重新修复10分钟，然后用PBS清洗它们4次，并在乙醇系列中脱水盖滑。用488端粒C-PNA探头在5微升杂交溶液中孵育覆盖滑，在75摄氏度下5分钟，然后在室温下在潮湿的室内孵育覆盖滑。在室温下，每次洗涤时用洗涤缓冲器清洗盖滑三次，每次洗涤两分钟，并在安装介质中每毫升 DAPI 安装一微克以进行成像。
对于实时成像，将盖片安装在环境室加热的磁室中，将细胞保持在一毫升成像介质中，而不会产生酚红色。设置文本手稿中描述的显微镜和环境控制装置。在端粒上找到具有明亮 GFP 信号的细胞，在细胞溶胶中定位扩散的 mCherry 信号。
查找大约 20 个单元格，使用 XYZ 信息记住每个位置，并设置延时成像参数。使用 0.5 微米间距，在 Z 中总共使用 8 微米，在 GFP 和 mCherry 通道中使用 5 分钟间隔，间隔 2 到 4 小时。使用 594 纳米的 30% 和 488 纳米功率强度的 50%，曝光时间为 200 毫秒，相机增益为 300。
开始成像，并采取一次循环作为预变色。然后暂停成像，将含有 15 微升 10 微摩尔变色器的 0.5 毫升成像介质添加到成像室，注意不要触摸舞台，并恢复成像。当准备反向变暗时，暂停成像，并在成像室中加入含有两个 100 毫摩尔库存 TMP 的微升成像介质 0.5 毫升。
继续对细胞进行一到两个小时的成像。对于固定成像，使用与实时成像相同的显微镜设置，但无需舞台加热。找到大约 30 到 50 个带有红色信号的细胞，以选择转染细胞。
获得0.3微米间距的图像，总间隔为8微米，Z.使用647纳米的80%、561纳米的80%和488纳米功率强度的70%，曝光时间为600毫秒，相机增益为300。使用端粒DNA鱼和SUMO蛋白免疫荧光鉴定了SUMO的端粒定位。与 SIM 突变招募的细胞相比，具有 SIM 征用的细胞丰富了 SUMO-1 和 SUMO-2 和 3，这表明 SIM 变小诱导端粒上的 SUMO 浓缩取决于 SUMO-SIM 交互。
此处显示二元化后 TRF-1 和 SIM 的延时电影。SIM 成功被招募到端粒中，SIM 和 TRF-1 foci 都变得越来越大，更亮，正如液体液滴形成和生长预测的那样。此外，还观察到TRF-1 foci的融合，这导致端粒聚集，如端粒数量的减少和端粒强度的增加。
相比之下，SIM突变体在变暗后被招募到端粒中，但没有诱导任何滴状或端粒聚类，表明相分离和端粒聚类是由 SUMO-SIM 相互作用驱动的。在添加多余的免费 TMP 后，观察到相分离和端粒聚类的逆转。端粒数量增加，端粒强度随着时间的推移而降低。
此处显示端粒 DNA 鱼和 PML 蛋白 IF 识别的 APB 代表图像。与 SIM 变异的细胞相比，使用 SIM 招募的细胞具有更多的 ABB，这表明二元化诱导冷凝水确实是 ABB。执行此协议时，不要将光敏变色器暴露在光线下。
在带红灯的黑暗房间里工作，在孵化过程中用铝箔包裹细胞。按照此程序，接近标记可用于生成诱导冷凝水中的组件的综合列表。实时成像可用于跟踪冷凝水中组件的动态。
这些方法可以帮助确定冷凝水成分控制的作用。
