这种方法使超分辨率低温成像成为可能，在整个生物细胞上精确识别细胞结构。它也可以与其他模式一起用作相关成像工作流程的一部分。该技术的主要优点是，超分辨率成像可以在低温条件下使用传统的荧光和相对较低的光剂量快速完成。
CyroSIM 是一种强大的工具，可深入了解细胞超结构动态，以响应内部或外部线索。其应用包括疫苗生产和推出、质量控制、后市场监控、抗体工程和优化以及纳米粒子表征。在低温阶段内操纵样品需要练习以确保网格的安全。
在数据收集之前，最好熟悉驾驶舱窗口中的控件。首先，从低温阶段的外部 Dewar 中取出盖子，倒入过滤液氮，直到大约四分之一满。等到最初的沸腾消退，然后浇注更多，并填补船舶约三分之二满。
小心地更换盖子，当液氮沸腾时，将喷嘴指向远离处理器的地方。一旦液氮停止从出口流出，将出口管放在低温台上的舞台上。插入电源，连接 USB 电缆，并将外部 Dewar 插入舞台。
液氮输送后，按低温台上的释放按钮，使其进入采样室，等待 30 到 45 分钟，系统冷却和稳定，然后再开始图像采集。使用盒式磁带工具上的六角钥匙打开样品转移盒的两个板。打开足够宽的板，以降低两个板之间的网格，但不打开到最大位置。
使用长钳将样品网格盒从液氮中取出。转动它，使音位与舞台内的存储位置对齐，并将其放置在舞台上。使用适当的设备将存储箱盖打开到正确的示例位置。
使用倒置钳子，从样品支架中取出 TEM 网格，将其浸入液氮中，确保碳膜侧放置，使其最终面对样品桥上的目标，并将其放入样品转移盒中的位置。使用盒式磁带工具上的六边形键关闭样品盒。使用盒式工具上的磁点将装有网格的墨盒提升到样板桥上并安装到样品桥上。
使其浸入或接近液氮并处于适当的方向。将盒式磁带平放在桥的定位别针内，轻轻轻推，以确保其固定。关闭并取出存储箱以及任何剩余的样品。
将低温阶段盖打开到成像位置，并关闭样品室灯。将舞台滑向光学元件，使其在客观透镜下对齐，然后使用杠杆轻轻将目标放入位置，确保其位于低温阶段的盖子内，但不会触摸它。用不透明的黑色窗帘覆盖舞台和光学，然后在低温SIM PC上启动控制软件驾驶舱。单击每个摄像机的读取模式按钮，并将其设置为 CONV3 巨型赫兹。
检查每台摄像机的温度是否为 80 摄氏度，并且摄像机风扇是否关闭。打开反射相机，在光线下，选择环境和下链接，检查冷凝器，然后单击视频模式按钮。在马赛克视窗中，缩小以查看网格轮廓。
如果无法看到"查找阶段"，请单击"查找"阶段，然后通过双左单击圆圈中间的网格进行中心位置。使用上下键对焦样本，直到网格支持胶片或任何其他相关功能处于焦点。使用数字垫上的九键和三键更改 Z 步骤。
一旦舞台以中心为中心，关闭视频模式。通过单击马赛克视图中的运行马赛克来收集可见光马赛克，从而生成从中心向外螺旋的可见光图像的瓷砖。点击"拯救马赛克"保存视图。
通过关闭环境光和冷凝器以及视频模式，检查亮场马赛克与以往任何荧光图图像一起，然后打开所需的激发激光，选择相应的相机和滤镜，最初在 50 毫瓦的曝光时间为 50 毫瓦。按零捕捉图像和星星以自动对比。或者，使用图像底部的滑块手动调整对比度。
一旦找到具有适当荧光的生物有趣的细胞，使用马赛克视图中的标记位置按钮标记它们的位置。在开始图像采集之前，请继续标记所有潜在站点。通过单击"保存"网站以归档，重新保存带有标记的站点的马赛克。
要使用缝合软件拼接马赛克图像，将文本马赛克文件拖动并放入带有扩展 BAT 的拼接图像中，并保存同一文件夹中马赛克瓷砖的组合 TIF 图像。要保存带有标记站点的图像，请同时将马赛克文本文件和标记文本文件拖放到图标中。根据相机视窗底部荧光图像中的计数和动态范围设置激光曝光时间。
选择应用哪个滤镜并优化要使用的每个激发光波长的设置，将每个激光单独打开。单击两个摄像机以打开它们。返回其中一个标记的站点，并再次关注所需的深度。
一旦在感兴趣的区域进行对焦，请使用宏级的 XY 窗口中的上箭头键移出焦点，以选择 Z 堆栈的高度来获取并单击"保存顶部"。使用向下箭头键移出对焦，单击"保存底部"，然后转到"中心"，验证图像是否仍处于对焦位置。在驾驶舱窗口中选择单点实验。
从下拉列表中选择结构照明。更改堆栈高度，使其等于 Z 高度加一微米。将反射相机上排的 405 和 488 纳米激光器的曝光时间以毫秒为数内输入，在传输相机的下排输入 561 和 647 纳米激光器的曝光时间。
输入文件名称并单击更新以生成包含日期和时间的新文件，而不覆盖以前的文件，然后单击"开始"。如果液氮 Dewar 在图像采集期间重新填充低温阶段，请单击驾驶舱软件中的 ABORT 按钮来中止过程。在每个位置，通过关闭激光并打开环境光和冷凝器，使用可见光收集 Z 堆栈。
在单个站点实验下，选择 Z 堆栈，并将环境光设置为 20 毫秒曝光，保持 Z 高度。对于所有标记的站点重复此过程。成像完成后，撤除舞台并移除所有样品。
关闭样品室灯。拔下外部德瓦尔插头，将剩余的液氮倒入另一个与低温相容的容器中，使德瓦尔能够安全地恢复到正常温度。等待，直到选项烘烤出低温阶段显示变得可用后，没有更多的液氮留在阶段德瓦尔。
按下烘烤按钮进入加热模式。将盖子插头放在低温舞台上。低温SIM的分辨率明显高于标准表观显微镜中的分辨率。
传统表观显微镜的荧光图可用于定位成像感兴趣的区域，并且可以从网格上的位置获取相应的低温SIM图像。含有 U2OS 细胞的样品被绿色微管细胞骨质染料和红色线粒体染料的混合物弄脏，导致细胞骨骼和线粒体的微管成分染色。随后的成像显示细胞内线粒体的定位，以及微管的排列，突出了它们为细胞提供的结构框架，以及细胞骨架周围的组装。
SIM 重建过程可以生成可使用 SIM 检查（免费图像J 插件）识别的文物。使用 SIMCheck 生成的调制对比图显示了核区域内的低调制对比度区域，表明该区域将更容易受到重建文物的影响。白色箭头表示重建文物。
在尝试此协议时，确保样品随时保持浸入或接近液氮，以避免去病毒化。还要注意动态范围内的暴露时间和计数，因为这会影响数据质量，避免激光对样品造成损害。低温成像后，可以用其他方式（如低温软 X 射线断层扫描）对相同的样本进行成像，我们在 B24 Beamline 中也有这种断层扫描。
通过将低温SIM图像与包含细胞结构信息的图像相结合，我们可以回答有关细胞超结构和功能的关键其他问题。
