该协议已被开发用于以低毫克尺度生产全长亨廷蛋白变体。它允许对HD研究人员至关重要的一致高质量蛋白质。演示该程序的将是来自库里亚实验室的研究科学家迈克尔哈里斯。
首先将一克聚乙烯亚胺 25 K 加入一升内毒素游离水中，搅拌均匀。使用100毫摩尔盐酸将pH调节至2.0，搅拌直至所有聚乙烯亚胺溶解。然后使用100毫摩尔氢氧化钠溶液将pH调节至7.0，并将溶液通过0.2微米过滤器。
制作过滤溶液的等分试样，并将其储存在零下20摄氏度。在补充有青霉素链霉素的生长培养基中，在37摄氏度，90RPM，5%二氧化碳的湿化摇床培养箱中传播HEK293细胞18至24小时。转染前一天，在五升锥形瓶中的两升生长培养基中以约1.2×10的密度将细胞稀释至每毫升第六个动力细胞，并孵育18至24小时。
在孵育结束时，按照制造商的说明使用自动细胞计数器测量细胞密度和活力。计算转染所需的聚乙烯亚胺和质粒的量后，在100毫升PBS中单独稀释聚乙烯亚胺和质粒，并在室温下孵育5分钟。然后，通过轻轻旋转混合稀释的质粒和聚乙烯亚胺，并将混合物在室温下孵育30分钟。
将混合物加入细胞培养物中，轻轻旋转混合。现在，让细胞生长24小时。第二天，将丁酸钠溶液以1：1， 000体积比加入终浓度的2毫摩尔抗结块和消泡剂中，并将细胞在加湿振荡器培养箱中孵育48小时。
测量细胞活力和密度后，通过以2， 000G离心30分钟来收获细胞，并在纯化前将细胞沉淀储存在零下80摄氏度。对于使用 FPLC 的防 FLAG 纯化，使用缓冲液 A 以每分钟 4 毫升的流速将 12 至 25 毫升的抗 FLAG 树脂包装到空柱上，并调整柱塞的高度以去除柱塞末端和树脂床之间的间隙。接下来，将解冻的细胞沉淀悬浮在冷裂解缓冲液中，并以每平方英寸1， 000磅的压力将细胞悬液通过高剪切均质器一次。
使用配备有兼容固定角度转子的离心机，以20， 000 G澄清裂解物一小时。在方法窗口下对FPLC进行编程，通过样品泵加载澄清的裂解物，并按照文本手稿中所述，用所需色谱柱体积的缓冲液A、B、C、D和洗脱缓冲液洗涤色谱柱。运行完成后，使用 SDS-PAGE 分析 10 μL 的峰级分。
将峰级分与所需纯度合并，并保存约50 μL的合并洗脱液，用于进一步的SDS-PAGE分析。开始使用FPLC平衡SEC色谱柱，并通过50毫升超级环加载抗FLAG洗脱液。运行 SEC 缓冲液后，让 SEC 分离在 4 摄氏度下过夜。
将洗脱曲线与标准HTT洗脱曲线进行比较，以区分单体、二聚体和高阶低聚峰。根据SEC色谱柱的洗脱曲线合并单体HTT馏分，如果需要，分别合并高阶低聚和二聚HTT馏分。使用100千道尔顿离心浓缩器在4摄氏度下浓缩混合的HTT蛋白。
计算蛋白质浓度后，在冷冻安全的微量离心管中等分少于100微升纯化的HTT蛋白。使用液氮快速冷冻等分试样并将其储存在零下 80 摄氏度。在HPLC系统上执行所有4摄氏度的SEC-MALS分析，并结合紫外检测器，多角度光散射检测器，微分折射率检测器，并使用0.185作为HTT的折射率增量。
用过滤的HPLC级水吹扫泵和检测器，并将UHPLC色谱柱连接到系统。用过滤水平衡色谱柱，然后用SEC-MALS缓冲液，直到所有检测器信号达到基线。以每分钟0.3毫升的流速注射两微升BSA溶液，每次注射15分钟。
检查数据质量，根据BSA配置文件执行归一化、峰对准和谱带展宽校正，并为以下HTT样品运行创建模板。使用浮子在室温水浴中快速解冻一瓶FL Q23-HTT样品。通过 0.1 微米的自旋滤光片过滤 HTT。
注入两到四微升的HTT样品，在4摄氏度下以每分钟0.3毫升的流速运行15分钟。使用随附的软件分析色谱和光散射数据，并生成Zimm图以确定每个峰的重均分子量。在本研究中，使用两步柱工艺，HTT的纯度大于95%，主要污染物是伴侣Hsp70，在抗FLAG亲和纯化步骤中用氯化镁和ATP大量洗涤消除了Hsp70 FL HTT的过表达可导致蛋白质片段化，但该方法产生的FL Q23-HTT分离为正确分子量为350 kdalton的单条带表明没有破碎。
抗体与FL Q23-HTT反应后的蛋白质印迹分析表明，由于未观察到任何其他片段相关条带，因此分离出该蛋白时没有明显的可检测截断。FL HTT 多 Q 长度方差、Q23、Q48 和 Q73 在蛋白质印迹中如预期反应，显示多 Q 定向单克隆抗体 MW1 的信号逐渐增强，与 Q 长度增加相关。在测试的HPLC色谱柱中，SEC色谱柱在HTT单体和二聚体之间显示出足够的分离度，因此可以区分摩尔质量。
来自SEC的纯化FL HTT显示出对应于寡聚态的多个条带，这可能是因为存在几个疏水贴片，这些贴片有助于在凝胶内迁移过程中形成高阶低聚物。纯化的HTT在蓝色天然PAGE上显示出三个主要条带，估计分子量为643、927和1，070千道尔顿，可能分别代表HTT的单体、二聚体和三聚体物种。正确处理纯化的亨廷顿蛋白对于避免在可溶性聚集体中产生高阶低聚物至关重要。
最终用户必须快速工作，在快速冷冻之前将样品分配到预冷管中。可以对长时间储存在零下80摄氏度的样品进行长期稳定性测试。重复HPLC SEC-MARS分析将确认样品的单体含量是否有任何变化。
