小鼠原代肺内皮细胞的分离

该协议展示了一种可靠且可重复的方法来分离和培养来自小鼠的高纯度内皮细胞，这些细胞可能具有多种应用。该技术是一种更直接的方法，可保留内皮细胞的产量和纯度。演示该程序的将是我实验室的研究员Nina Nguyen。

首先，涡旋磁珠几秒钟。将50微升珠子移液到两个1.5毫升微量离心管中，用于CD31和CD102。加入一毫升珠洗缓冲液并混合均匀。

将试管放在磁选机上，并用玻璃巴斯德移液管除去上清液。将珠子重悬于50微升珠子洗涤缓冲液中。然后在每 50 微升珠子中加入 5 微升或 2.5 微克 CD31 或 CD102 抗体。

将珠悬浮液在末端旋转器上轻轻旋转，在 4 摄氏度下孵育过夜或在室温下孵育 3 小时。洗涤免疫珠四次，然后将免疫珠重悬于50微升微球洗涤缓冲液中。在隔离当天，将25毫升HBSS加入25毫克一型胶原酶中，并轻轻旋转孵育。

然后使用22微米过滤器过滤。对五到七天大的老鼠幼崽实施安乐死后，用 70% 乙醇喷洒尸体。接下来，沿着胸部的整个侧壁向上切横膈膜，以露出胸腔。

将五毫升冷DMEM注入心脏的右心室，直到肺部变白。然后将相应支气管远端的叶逐个切开，以切除肺部。将肺叶拉入预装有 20 毫升冰冷基础培养基的 50 毫升锥形管中。

用手轻轻搅拌管子 10 到 15 秒，以清洗任何多余的红细胞。用细胞过滤器从培养基中取出肺，并用无菌剪刀切碎。将切碎的组织转移到装有25毫升预热胶原酶溶液的50毫升锥形管中。

在旋转搅拌器上轻轻搅拌。将 20 毫升注射器连接到 15 号钝套管上，并剧烈研磨悬浮液，不要在细胞悬浮液中起泡 10 到 15 次。通过70微米细胞过滤器将悬浮液过滤到50毫升锥形管中。

然后用15毫升基础培养基冲洗用于消化的锥形管和细胞过滤器。在 400 摄氏度下以 400 倍 G 离心细胞悬液 8 分钟。将沉淀重悬于两毫升完全培养基中。

加入八毫升完全培养基并孵育。第二天，用10毫升不含钙和镁的HBSS洗涤烧瓶两次，并加入10毫升完全培养基。一旦细胞汇合90%至95%，它们就可以进行原发性免疫珠分离。

用10毫升不含钙和镁的HBSS洗涤贴壁内皮细胞两次。加入两毫升无胰蛋白酶细胞分离溶液并孵育，以确保从烧瓶中取出所有细胞。加入八毫升基础培养基。

接下来，在室温下以400倍G旋转细胞四分钟，并将它们重悬于两毫升的基础培养基中。涡旋抗CD31包被的磁珠几秒钟以重悬磁珠。每两毫升细胞悬液添加 30 微升珠子并盖上盖子。

将试管在室温下在端部旋转器上孵育 10 分钟。然后将试管放在磁选机上两分钟。吸出上清液并从磁铁上取出管。

通过将三毫升基础培养基添加到试管中并上下移液数次来重悬珠细胞沉淀。更换磁选机上的管子两分钟。然后使用玻璃巴斯德移液管小心地吸出上清液。

最后一次洗涤后，当上清液变得澄清时，将珠细胞沉淀重悬于三毫升完全生长培养基中，并将其转移到T75烧瓶中。加入七毫升完整的生长培养基并孵育。第二天，用不含钙和镁的HBSS重新洗涤细胞。

然后加入10毫升完全培养基。一旦细胞汇合90%至95%，它们就可以进行二次免疫珠分离。第一个免疫珠选择可识别以鹅卵石形式生长的CD31阳性细胞。

使用抗CD102包被微球的第二种免疫微球选择可提高内皮细胞纯度，并使用荧光活化细胞分选来确认细胞群为CD31阳性和CD102阳性。为了研究内皮炎症途径和内皮屏障功能，使用小鼠Cytomix处理诱导P值小于0.01的内皮细胞显着产生IL-6。此外，跨内皮阻力降低，显示内皮通透性增加。

分离的内皮细胞可用于内皮细胞刺激或屏障功能测定，以发现基于内皮的内皮功能障碍治疗靶点。