基于激光显微切割的协议，用于神经黑色素颗粒蛋白质组学谱的LC-MS / MS分析

我们的激光显微解剖和质谱相结合，可以在任何种类的组织中研究蛋白质组学水平的空间分辨变化。在我们的例子中，神经黑色素颗粒。我们的协议允许基于有限的样品材料进行蛋白质组学分析。

在处理死后脑组织时，这通常是一个很大的挑战。由于可以分离单细胞以在蛋白质组学水平上比较健康和疾病状况。这可能会增强我们对疾病机制的理解。

首先，将组织膜载玻片放在机器人载物台上的载玻片支架中，组织朝上。获取组织切片的概览扫描。使用扫描功能，从左上角和右下角选择感兴趣的区域。

然后选择扫描所有 ROI 以执行扫描。用于在当前视野中自动选择神经黑色素颗粒。选择视野分析。

然后选择反转结果，并设置 RGB 通道的阈值。因此，在预览窗口中仅以红色突出显示神经黑色素颗粒。现在单击确定，以使用调整后的视野设置。

仅使用被膜覆盖的载玻片区域调整激光设置。用50微升超纯水填充样品收集管盖。并将盖子插入机器人移动器的收集器中。

使用软件界面，将机器人搬运工放置在机器人第二阶段上方，开始收集样品。启动激光。在激光加工过程中控制能量和焦点设置，并在必要时调整设置。

确保至少前 10 个物体将隔离的物体正确隔离并弹射到样品收集管盖中。取样完成后，将机器人搬运机导航到其起始位置并取出样品收集管。通过离心旋转样品后。

将样品在真空浓缩器中干燥1.5小时。按照文中所述进行三重消化后。通过将 200 至 400 ng 样品肽溶解在规定的 0.1% TFA 体积中，制备用于 HPLC-MS 分析的样品。

在惰性质谱玻璃小瓶入口中。如果由于样品量低而无法进行浓度测定。通过比较总离子电流来验证相同的样品上样量。

开始蛋白质组学原始数据分析。单击加载以将原始文件加载到软件中。单击“设置实验”以分配样本名称。

定义组特定参数。通过选择脱酰胺NQ、氧化M和脲甲基化N项作为变量修饰来添加修饰。然后加入氨基甲酰甲基化C作为固定修饰。

在消化选项卡中选择胰蛋白酶作为消化酶。在无标签定量选项卡中，添加选项 LFQ，如果要处理的文件超过 10 个，请选择快速 LFQ 选项以缩短处理时间。确保所有其他组特定参数保留在出厂设置中。

进入全局参数选项卡，然后添加从 uniprot 派生的 FASTA 文件。组织在序列选项卡中。相应地修改标识符规则。

并添加智人的分类学ID 9606。对于蛋白质定量，请选择独特的剃刀肽。然后在无标记定量选项卡中添加iBAQ选项作为蛋白质定量的度量。

确保所有其他全局参数保留在出厂设置中，然后单击开始。成功执行分析后，检索蛋白质组。TXT 输出。

加载蛋白质组。分析软件中的 TXT 文件。将 iBAQ 值添加为主列，并根据其类型对所有其他列进行排序。

通过基于分类列筛选行并根据有效值筛选结果来筛选诱饵和污染物。以 txt 格式导出输出以供进一步处理。并评估有关研究问题的结果。

在本研究中，在NMG中鉴定了1， 898个蛋白质组，在周围的SN组织中鉴定了1， 565个蛋白质组，其中1， 384个在两个组织区域中都鉴定出来。因此，分别在NMG和SN组织中独家鉴定了514和181个蛋白质组。在具有代表性的DDA测量中。

与SN相比，NMG中的iBAQ值略高，表明NMG中蛋白质细胞质dynien-1，重链1的丰度更高。这一观察结果可以在肽ESPEVLLTLDILK的PRM实验中得到验证。其中检测到更高的NMG丰度。

基于 MS1 和 MS2 水平的峰面积。到目前为止，最重要的步骤是NMG的隔离，因为协议的其余部分基于此步骤才能正确执行。在LMD程序之后，样品可用于任何类型的组学技术，例如基因组学，转录组学，蛋白质组学或脂质组学。