用于外周神经工程的石墨烯基3D生物杂化水凝胶生物墨水的制备与表征

干细胞系统受到其重要成分的影响。如果没有干细胞的微环境的存在，干细胞的保存和分化是不可想象的。这种微环境称为干细胞生态位，由细胞和支架组成。

周围神经病变可以是，偶尔，它们可能是臂丛损伤，各种创伤，肿瘤，自主神经异常，免疫定义和代谢性疾病。已经开发了各种3D培养方法，为干细胞提供更好，更自然的生态位。球状体形成和3D生物打印是相对较新和有前途的3D培养方法。

3D生物打印也可用于神经工程研究。因此，在这项研究中，开发了基于石墨烯和藻酸盐/明胶的生物墨水，并研究了它们的再生特征。首先，在室温无菌层流下，在含有 10% 胎牛血清或 FBS、1% 笔/链球菌和 1% L-谷氨酰胺的 DMEM F12 培养基中培养沃顿的果冻间充质干细胞或 WJMSC。

当培养的细胞在烧瓶中80%汇合时，倒入培养基并用5毫升PBS洗涤细胞。然后加入5毫升0.25%胰蛋白酶和2.21毫摩尔EDTA钠，并在37摄氏度下孵育。五分钟后，向细胞中加入10毫升含有10%FBS的DMEM F12培养基。

悬浮细胞，收集培养基并将其转移到离心管中。接下来，离心细胞并弃去上清液，然后将细胞重新接种到含有10%FBS的新鲜营养培养基的新烧瓶中。为了制备不含石墨烯的对照组的生物墨水，称取4.5毫克藻酸盐和1.5毫克明胶，并将它们转移到离心管中。

然后将 50 毫升含有 10% FBS 的 DMEM F12 培养基加入试管中。再次称取4.5毫克海藻酸盐和1.5毫克明胶，并将它们转移到离心管中。然后在管中加入50微升0.1%石墨烯，并用含有10%FBS的DMEM F12培养基使体积为50毫升。

通过移液和涡旋混合生物墨水，然后在 121 摄氏度下 1.5 下高压灭菌。大气压20分钟。高压灭菌后，离心溶液以去除形成的气泡，并将生物墨水置于37摄氏度，直到准备好细胞。

对于细胞生物墨水相互作用，创建生物墨水组。第一组包括用生物墨水打印的3D-B和3D-G，用于生物打印。第二组包括3D-BS和3D-GS生物墨水，生物打印后在其上形成球体。

对于第一组，将细胞计数为1乘10至0.5毫升培养基中的第七个细胞。然后加入4.5毫升生物墨水。使用注射器将混合物转移到无菌柜中的墨盒中。

将墨盒安装在生物打印机的相应挤出机部分。对于第二组，从每个生物墨水组中取出五毫升生物墨水，并在注射器的帮助下将它们转移到无菌墨盒中。使用带有两个同轴打印头和气动驱动挤出技术的生物打印机。

将每微步的XYZ分辨率设置为1.25微米，将挤出宽度设置为400微米，将挤出高度设置为200微米。使用 20 x 20 x 5 毫米的网格创建 3D 模型。使用基于 Web 的开源 CAD 程序创建 3D 模型。

对于3D生物打印过程，将打印机的平均压力设置为7.5 psi。然后将墨盒和床身温度设置为 37 摄氏度，速度设置为 60%在写入阶段将系统置于原位。在开始生物打印过程之前，自动定位轴并选择和设置挤出机。

打印后，取出样品并将其放在层流柜下。接下来，用0.1普通氯化钙溶液喷洒生物墨水，或在室温下用移液管加入一毫升溶液，等待10至20秒。然后用含有钙和镁的PBS清洗印刷图案两次。

在每个含有生物墨水基团的细胞顶部加入两毫升含有10%FBS的DMEM F12培养基，并将板在37摄氏度下与5%二氧化碳孵育30分钟。接下来，向每组的第六个细胞中加入两毫升含有1×10的悬浮培养基，并孵育板。24小时后，在倒置显微镜下观察并拍摄所有批次的生物墨水以形成球状体，以便WJMCs分化为神经元样细胞，对照组除外。

每孔加入两毫升神经分化培养基，每两天更新一次。随访七天以观察神经分化。接下来，使用延时成像，检查石墨烯对干细胞的影响并监测生物墨水中的细胞相互作用。

这里展示了石墨烯浓度对细胞增殖的影响。与对照相比，观察到0.001%石墨烯浓度显着降低。其他组与对照组之间无显著差异。

细胞石墨烯相互作用表明，石墨烯在2D系统中是耐受的，并通过内吞作用被细胞吸收。延时成像显示，在3D石墨烯培养基中存活的细胞通过GFP亮度保持其活力，直到孵育结束。此处显示了 3D-B 和 3D-G 生物墨水组的 SEM 图像和 FIIR 分析。

生物墨水细胞相互作用在表面和内部都得到了证实。细胞在形态上是圆形的，并附着在材料上。在3D神经元分化中，认为两组球状细胞的边界透明而活泼，石墨烯组中的球体相对较大，并将石墨烯困在细胞内。

此处显示了 2D 和 3D 细胞的免疫染色。绿色图像代表神经元样结构。2D阳性对照样品表达的神经元样结构标志物少于3D样品。

我们发现基于石墨烯的生物墨水在干细胞分化为神经元样细胞方面更成功。我们建议基于石墨烯的生物墨水将成为进一步研究中治疗周围神经疾病的优秀工具。今天，干细胞系统可以通过组织工程与天然和合成生物材料创建人造组织，可以取代可用于这些组织再生的活组织，消除损伤并提供功能由组织工程提供。